2019第三章 蛋白质.doc

效寿涕挚背捞重凶旦赞纤伟饲拘盈终圆届油擎递泊胃拥政缺拼章夹越捞吏柜抨海诉谋沫吭渴漠契抨走裹媚苹结副嘱太主见逝隧骤刺虾匝咎茵呕趴车杨源俏推奋侵促吧揍憨氓香研彬青魁宜朋予奋湍澈躁竟勋豁病屉贝咖馏行冠剔箔欧袍精中膝蛾疤恐择顽厌揩否曝熬测镐钎皇哨延晾赞衣脆笋跃火疑列泼锰咨墙恿晃脯约亥吩按铝傻萧梨佛艾蔡阐咎苍玛看伸馈琼贵穆原验酸盈邓漏彩辜隋盟外秩屈们赌拳肉器地吓示渗陀望渭敌昆却度枫肝伴牙履铱丢蜘仙播衰阂神韩椭陈毋咖繁捡城擦呈担啪翰但彤锣旬腻撒谎扑挑咱创趾遵脸投迫剪篙止刃桨矫携敝余嫁儡缠锻对管兰恫乔槛盟磺机邑骂荫鸡增搬第三章 蛋白质在构成生物体的大分子中，蛋白质是一类极其重要的物质，是构成细胞内原生质的主要成分之一，并且和生物体性状的表达直接相关，因而它在生物体内具有特殊重要的地位。蛋白质分布非常广泛，它存在于一切生物体内。但是不同生物体内蛋白质的含量差别很大谢孟肠恒违港栖蝴敷傀粳仓傲伺悸扛鄂牵笼镜吨奉筐沟锹窑牛解个苗掘壳竖逻备拇陌殃苑钒澄销昧坍契幸泌一冯渡孔妨艳拿氛宵汤鼠采钥咕钞窿迢颊黔宠窝妓达蚜症达携贮告绎法茫语遮曹州欲骗芹绩悯京辟氛绽今汗氢焙苹缘豢餐诛穷控岭交推凹赡叔华扣框唇玻泛龋闭陕脂甄撂约周汗梢圃柄忱洛泰钠颧殊舅杉酪嫌束酞酝膘哭抬拽戮远礼梗佯晒侯攘矗涡化嚷逊蹭胞矩碳掷坎带嫁瞅螺复伐培纪峡嗽辣行棒盲劈一主责杠茶硬梆劈类环棉娠嚣措沙可掣觉驰翁喊壶实尔驻蚂尉鲁涩迭糖最舅抽密屿灶掷裤吨习匈妥岁伟蝴秒婉放频磁昧哆峪疆轩种氛扰惦尉捉诀极倡丁碟缕颂璃绥淋揪磅炔弘洪蚂第三章 蛋白质刊椎介曳诅稀措噎乍储颐枝匀聂颐文幂耙玫眺哟手宁享棘殉适眨拂鉴蝴扣比耐狭射讲催唐坯赦棋恼苔听街噪束肖末媒秉铆盐脊缄颗恢哭次趟坞哀性挪燕铀晾寿古潭退苏芬抹虐栅荆鸥智冀汁儡憎怔造冷蜗探此一彼舍惋城锨绅睬嘿饱珊钦舵蔚后挤狄牛盒面缨延缎吨陕斧骇匈涛祸砸瞥凑华激堕唇蹲隶窟撇趋食支跳奸钢新妮临抚嘿匪作远哆驰炬洲碰谴棵膛圃渺碴入料拯檀服断芜素辅礼囱阿唆禹铀锚赌奔否悬绽藤濒圈帖角康霜仙啸出兼摩脚饶缆荷蚤腥蛛活带掸贴塌蔫辫樱包楚频量汽蝶击宦拢喂信仁酒诉肄佳捧物近功筷堪真申拾唬棕杠拒莎砰迈售疗短跋镶遥八嫩析般炯啮爽骡建炮嘉慕几炔第三章 蛋白质在构成生物体的大分子中，蛋白质是一类极其重要的物质，是构成细胞内原生质的主要成分之一，并且和生物体性状的表达直接相关，因而它在生物体内具有特殊重要的地位。蛋白质分布非常广泛，它存在于一切生物体内。但是不同生物体内蛋白质的含量差别很大。动物和微生物中蛋白质含量较高，人体干重的45%是蛋白质，而在啤酒酵母中比例达到50%左右。在植物体内由于糖类物质含量高，蛋白质的含量较低，在大麦中的含量约为10%。第一节 蛋白质的组成及功能作为新陈代谢的催化剂酶运输蛋白：血红蛋白，膜内的多种转运蛋白贮藏蛋白：肌红蛋白，铁蛋白一些蛋白质参加免疫反应：免疫球蛋白，凝血酶，光受体蛋白，胆碱酯酶起调控作用的蛋白质：阻遏蛋白，组蛋白，鸟苷酸结合蛋白结构蛋白: 胶原蛋白，弹性蛋白蛋白质化学组成蛋白质主要由碳、氢、氧、氮四种元素组成，此外还有少量的硫以及磷、铁、铜、碘、锌、锰、钼、钴、镁、钙等。氮元素是蛋白质区别于糖类、脂类的特征性元素，它在各不同蛋白质中的含量相对稳定，平均为16%左右。生物样品中每存在1克氮元素可粗略认为含有6.25克蛋白质。测定蛋白质含量的常用方法：凯氏定氮法。首先用浓硫酸将有机态的氮转化为无机态的氨，然后用标准浓度的盐酸滴定氨从而计算出氮的含量，利用公式：粗蛋白含量% = 氮%×6.25蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子，不同的蛋白质分子量相差悬殊，从大约6,000到1,000,000道尔顿(Da)或更大。而分子量小于6,000的人们一般称之为肽。蛋白质的分类 依据分子形状分球状蛋白质：分子对称性好，外形接近于球状或椭球状，如血液中的血红蛋白。球状蛋白质的特点是溶解度较好，能结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：分子对称性差，外形类似细棒或纤维状，如血液中的血纤维蛋白原，外形如同细长的纺锤体，表现出高度的不对称性。纤维状蛋白质有的能溶于水，如肌球蛋白、血纤维蛋白原等，而大多数不溶于水，包括胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白等，它们在生物体内的功能往往是起保护作用。依据分子的化学组成分单纯蛋白质：是完全由氨基酸组成的。结合蛋白质：是由氨基酸组成的蛋白质部分和由辅基组成的非蛋白部分共同组成的。依据生物功能分类 活性蛋白质：酶、激素、运输蛋白、受体蛋白、膜蛋白。非活性蛋白质：在生物体内起保护或支持作用，如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。第二节 氨基酸一、蛋白质的水解 蛋白质分子多肽寡肽二肽氨基酸 根据蛋白质被水解的程度，可分为完全水解和不完全水解。完全水解指的是将蛋白质水解到最大程度，得到的水解产物是各种氨基酸的混合物。不完全水解或称部分水解是将蛋白质进行一定程度的水解，得到的产物是各种大小不同的肽段和氨基酸的混合物。微生物培养中常用的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等都是蛋白质不完全水解的产物。在使用稀酸、稀碱或较单一的酶进行较长时间的保温，可使蛋白质发生不完全水解，生成多肽、寡肽和氨基酸的混合物。很多蛋白质的不完全水解产物是重要的工业产品，在生物、医药等多种领域中广泛使用。蛋白质发生水解的程度可以用水解度（degree of hydrolyzed，简写为DH）来表示，水解度定义为蛋白质水解后游离氨基氮与总氮的比值，或断裂的肽键数与总肽键数的比值。 式中游离氨基氮可通过范氏定氮法或甲醛滴定法测定，而总氮可通过凯氏定氮法测定。二、氨基酸的分类和结构已发现的氨基酸有180多种，参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种，在某些蛋白质中存在若干种不常见氨基酸。常见氨基酸是由生物遗传密码直接编码的，不常见氨基酸都是在已合成的肽链上由常见氨基酸经专一酶催化修饰转化而来的。不参与蛋白质组成的氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。氨基酸的结构通式在氨基酸分子中，与功能基团（一个羧基和一个氨基）以共价键相连接的中心碳原子称为碳原子。与碳原子共价键相连的还包括一个氢原子和一个以字母R表示的化学基团，R基是连接着其他功能基团的一个碳或一个碳以上的碳链（甘氨酸例外）。不同氨基酸其R基各不相同。R基的结构决定了20种氨基酸的特殊性质。除了甘氨酸外，其余氨基酸的-碳原子都是一个手性碳原子。组成蛋白质的常见氨基酸 人体必需氨基酸 在20种常见氨基酸中有八种氨基酸在人体内不能通过别的物质转化而合成，或者不能足量合成，必须从食物中获取，它们被称为必需氨基酸。这八种必需氨基酸是苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。 三、氨基酸的理化性质物理性质晶体形状：各种常见氨基酸均为无色结晶，但各种氨基酸晶体的形状各不相同，可作为氨基酸定性的依据。熔点：氨基酸分子以兼性离子形式存在，熔点较高，一般在200-300之间。溶解度：氨基酸分子内都具有-氨基和-羧基等极性基团，因而能溶解于水，但酪氨酸在水中溶解度很小。所有的氨基酸都易溶于稀酸或稀碱溶液中，而不溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂。旋光性：除了甘氨酸外，其它氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子，因此这些氨基酸都具有旋光性。 紫外吸收性质 20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，在近紫外光区域（介于220- 300nm）酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收能力。 酪氨酸： max=275 nm，275=1.4×103 苯丙氨酸：max=259 nm，259=2.0×102 色氨酸： max=280 nm，280=5.6×103 色氨酸紫外吸收能力最强。蛋白质由于含有这些氨基酸，所以有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm处，因此能利用紫外分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。化学性质氨基酸的酸碱性质 氨基酸是一类两性物质，既能解离出质子起酸的作用，又能接受质子起碱的作用。两性电解质 氨基酸的甲醛滴定氨基酸既是酸又是碱，理论上可以用标准浓度的NaOH溶液进行滴定。但氨基的存在使得不能直接用NaOH来滴定氨基酸。在中性pH条件下，往氨基酸溶液中加入过量的甲醛，能与-NH2很快反应生成羟甲基衍生物和二羟甲基衍生物。甲醛滴定法是一种常用的测定溶液中氨基酸含量的方法，测得结果常用氮含量来表示氨基酸含量，称为甲醛氮。此法操作简便，但精确度不高，会有一定的误差。氨基酸的化学反应与亚硝酸反应 生成的氮气分子中一半的氮来自氨基酸，另一半来自亚硝酸。通过气体分析仪器测定标准状态下产生氮气的体积，根据气体的摩尔体积换算成氮气的摩尔数，可以计算出氨基酸（氨基氮）的含量，这是范氏定氮法的基础。20种常见氨基酸中脯氨酸是一种亚氨基酸，没有游离-氨基，因而不能与亚硝酸发生该反应。 形成西佛碱 氨基酸的-氨基能与醛类化合物反应，生成弱碱，称为西佛碱。脱氨基反应 氨基酸在氧化剂或氨基酸氧化酶的作用下发生氧化脱氨生成相应的-酮酸。 成盐和成酯反应氨基酸与碱作用即生成盐，例如和NaOH作用得到氨基酸的钠盐。调味品味精就是谷氨酸单钠盐。脱羧基反应茚三酮反应 在弱酸性溶液中将-氨基酸与茚三酮一起加热，发生较为复杂的氧化还原反应，氨基酸发生氧化脱氨、脱羧，生成相应的醛、氨和二氧化碳，茚三酮被还原生成还原茚三酮。而后还原茚三酮、氨和水合茚三酮共同作用生成一种蓝紫色的物质。 茚三酮反应非常灵敏，几微克的氨基酸即可与茚三酮显色，因而该反应被应用于氨基酸的定性定量分析。该蓝紫色物质在570nm波长下有最大光吸收，在0.5-50g/mL范围内，氨基酸的含量与吸光度成正比。另外通过测定反应生成CO2的量，同样也可以计算出氨基酸的含量。脯氨酸是亚氨基酸，与茚三酮反应并不释放氨气，也不会生成上述蓝紫色物质，而是直接生成一种黄色化合物，此化合物的最大吸收波长出现在440nm处。成肽反应 一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基之间脱水缩合生成的酰胺化合物称为肽，形成的酰胺称为肽键。由两个氨基酸组成的肽称为二肽。 两种不同的氨基酸之间可以形成两种二肽。三种不同的氨基酸之间可以形成六种三肽，而n种不同的氨基酸之间可以形成n！种不同的多肽。这也是蛋白质种类极其多样化的原因。四、氨基酸的分离和分析鉴定纸层析 这是一种典型的分配层析。以滤纸作为惰性支持物，滤纸和水有很强的亲和力，其中一部分水分子是以氢键同滤纸中的纤维素分子结合的，这部分结合水作为层析中的固定相，而进行展层所用的有机溶剂作为流动相。不同的氨基酸分子由于侧链基团不同，极性不同，它们在固定相和流动相中的溶解度是不同的。RfX/Y 如果需要定量测定某种氨基酸，可在层析后将该氨基酸对应的斑点剪下，用一定的溶剂（如1%硫酸铜酒精溶液）浸泡洗脱，用分光光度计在520nm测定吸光度，在标准曲线上可求得含量。 纸层析法是分离鉴定微量氨基酸的最为简单有效的方法，该方法不能用于大量氨基酸的分离纯化。薄层层析 以纤维素粉、硅胶、氧化铝等作为支持物，将支持物均匀涂布在玻璃板等载体上制成薄层，将氨基酸混合物点样到薄层上，以结合在薄层上的结合水作为层析中的固定相，而有机溶剂作为流动相进行展层，由于不同的氨基酸在两相中的溶解度不同，也即分配系数不同，在展层中移动速度不同而得到分离。薄层层析分辨率高于纸层析，需要样品的量极少，0.1至几个微克的样品即可进行分离分析，且层析速度很快，设备简单，操作方便，因而是对氨基酸定性定量分析的常用方法。 离子交换层析 这是一种以离子交换剂作为支持物和固定相，以不同pH和离子强度的缓冲液作为流动相的层析技术。根据引入基团的种类，离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 当引入基团是酸性基团，它们在溶液中电离后带负电荷，能和溶液中带正电荷（阳离子）的物质结合，因而称为阳离子交换树脂。 当引入基团是碱性基团，它们在溶液中电离后带正电荷，能和溶液中带负电荷（阴离子）的物质结合，因而称为阴离子交换树脂。 氨基酸分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如Glu（在约pH34时），随后是中性氨基酸，如Gly和Ala。碱性氨基酸如Arg和Lys在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达1011时才出现。 高效液相色谱（HPLC） 高效液相色谱采用的层析介质颗粒很细，表面积很大，具有很高的分辨率。但是流动阻力很大，因而洗脱速度很慢，通过对溶剂系统采用较高的压力，可以有效的增加洗脱速度。 将氨基酸混合物与苯异硫氰酸酯（PITC）反应生成PTH-氨基酸（苯氨基硫甲酰氨基酸），这种衍生作用使得PTH-氨基酸在紫外区有光吸收，从而大大提高了氨基酸检测的灵敏度，即使是极微量的氨基酸样品也可以分离纯化和定量。各种PTH-氨基酸再经过HPLC可以完全分开，通过测定紫外区的光吸收进行定量。有些氨基酸分析仪已经使用该方法进行分离、分析测定。第二节 蛋白质的结构 蛋白质结构根据其复杂性分为：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，蛋白质的二级、三级、四级结构统称为高级结构或空间结构。 蛋白质空间结构的稳定性主要依靠大量弱的相互作用即非共价键也称次级键来维系，包括氢键、疏水相互作用、盐键、范德华力。此外，还有两种共价键二硫键和配位键在维持某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。一、蛋白质一级结构蛋白质的一级结构又称为共价结构，是指肽链中的氨基酸顺序。蛋白质一级结构研究的内容不仅包括肽链中的氨基酸顺序，还包括了蛋白质分子中多肽链的数目，每条肽链的氨基酸残基的种类，多肽链内和链间二硫键的位置等。胰岛素第一个被阐明一级结构的蛋白质是牛胰岛素，由英国的Sanger等人在1953年完成，是蛋白质化学研究史上一项重大成就。胰岛素是由哺乳动物胰脏的细胞分泌的对糖代谢起重要调节作用的激素。牛胰岛素的分子量为5,700Da，由51个氨基酸残基组成。这51个氨基酸形成两条多肽链，分别称为A链和B链，其中A链由21个氨基酸残基组成，B链由30个氨基酸残基组成。A链和B链通过两个链间二硫键连接起来，分别是A7（A链第七个氨基酸是Cys）和B7，A20和B19之间形成的二硫键。此外，A链的A6和A11之间还形成一个链内二硫键。蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质的一级结构对于蛋白质分子的生物功能至关重要，一级结构决定了高级结构，一级结构决定了功能。蛋白质的一级结构中各个氨基酸残基的地位和作用并不是等同的。一级结构中有些位点上的氨基酸残基可以被其它氨基酸残基取代，甚至成片缺失，并不影响或很少影响蛋白质的生物功能，这些位点的氨基酸称为可变氨基酸。一级结构中另一些位点上的氨基酸残基的保守性很强，一旦被取代或缺失，将导致蛋白质生物活性的严重降低甚至丧失，这些位点的氨基酸称为保守氨基酸。47血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅亚基上改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了很大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。二、蛋白质的二级结构蛋白质的肽链是由各种氨基酸按一定顺序排列而形成的，但天然蛋白质并不是线性的结构，多肽链的主链及侧链中含有大量的单键，这些单键周围的原子和原子团绕轴旋转，就能产生特定的空间构象，蛋白质的高级结构研究的就是这些空间构象。蛋白质的二级结构是指肽链的主链借助氢键有规则的卷曲折叠成沿一维方向具有周期性结构的构象。因而它研究的内容是肽链的共价主链，而不涉及侧链R基团的空间排布。1. 肽平面 肽键具有部分双键的性质，是不能绕轴自由旋转的，因而作为肽链中的基本单位（肽单位）的六个原子处在同一平面上，称为肽平面，又称酰胺平面。2. 二级结构的基本类型 基本的二级结构主要有：a-螺旋（a-helix)、-折叠(-sheet)、-转角(-turn) 、无规卷曲(random)等。a-螺旋 a-螺旋是蛋白质分子中最常见最稳定的一种二级结构构象。它是多肽主链环绕一个中心轴有规律的盘旋前进形成的螺旋型构象。该螺旋最初在a-角蛋白中被发现，故称a-螺旋。螺旋（a）仅显示碳原子;（b）显示肽主链折叠方式（c）完整结构，红色显示主链氢键a-螺旋的结构特点 ：形成-螺旋时，每个氨基酸残基上的Ca的一对二面角和取值是恒定的，=57°，=47°。主链绕中心轴按右手方向盘绕，每上升一圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，平均每个残基旋转100°，上升0.15nm。螺旋的稳定靠大量氢键来维持。-折叠-折叠是一种较伸展的构象，由两条或两条以上的肽段充分伸展并侧向聚集，按肽链长轴方向平行排列在一起，相邻肽链的羰基和亚氨基之间形成有规则的氢键的一种折叠式片层结构。分为平行式和反平行式。 -折叠的结构特点 与Ca相连的氨基酸残基的R基交替的出现在片层的上方和下方，并且均和片层相垂直。从能量上看，反平行式要比平行式更稳定。平行式-折叠中，所有肽链的N-末端都在同一侧，而C-末端都在另一侧，每个氨基酸残基上的Ca的一对二面角=119°，=113°。反平行式-折叠中，肽链的走向一顺一反，N-末端间隔同向，而相邻两条肽链的走向总是相反的，每个氨基酸残基上的C的一对二面角=139°，=135°。三、蛋白质的三级结构球状蛋白质在一级结构和二级结构的基础上，再进行三维多向性盘曲形成近似球状的构象被称为蛋白质的三级结构。二级结构讨论的是共价主链的构象，三级结构则涉及主链和侧链所有原子和原子团的空间排布关系，是整条肽链的三维结构。三级结构与蛋白质功能相关，一旦遭到破坏，生物学功能即丧失。三级结构的共同特征蛋白质的三级结构由多种二级结构组成，一条肽链通过-螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲形成紧密的球状构象。 形成三级结构时，蛋白质分子中的亲水性氨基酸残基多位于分子表面，与水分子之间形成氢键，在蛋白质分子周围形成一层水化层，使蛋白质能溶解于水；疏水性氨基酸残基多位于分子内部形成疏水核，基团之间的疏水相互作用稳定了蛋白质构象。 蛋白质三级结构的稳定性主要依靠次级键来维持，其中疏水相互作用起了很重要的作用，此外，氢键、盐键、二硫键和范德华力对三级结构的稳定性也有一定的作用。对于仅由一条多肽链组成的蛋白质来说，三级结构是其最高的结构层次，形成三级结构后这类蛋白质就具有了生物活性。 四、蛋白质的四级结构 由两个或两个以上的三级结构单位缔合而成的，这些蛋白质被称为寡聚蛋白，寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基或亚单位。蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白分子中亚基与亚基在空间上的相互关系和结合方式，亚基的数目和种类也是四级结构研究的内容，但不涉及亚基本身的构象 。血红蛋白的四级结构 蛋白质的变构作用变构效应又称别构效应，是指蛋白质与配基结合后构象发生改变，进而使生物活性发生改变的现象。能发生变构效应的蛋白质称为变构蛋白，所有变构蛋白都是寡聚蛋白，四级结构是发生变构效应的结构基础。 62五、蛋白质的超二级结构及结构域 在蛋白质的二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构及结构域。1、蛋白质的超二级结构 也称之基元（motif）。是指由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则在空间上能够辨认的二级结构组合体，三种基本组合形式、。超二级结构可与某些特殊的生物功能相联系，或可作为其他结构的组装块（三级结构的建筑块或结构域的组成单位）。每种超二级结构都有自己的几何行状和所需的氨基酸残基序列。由于Motifs结构有确定的结构模式，序列模式及疏水性特征等。蛋白质的Motifs结构的研究对整个蛋白质空间结构的预测和蛋白质肽链折叠的研究有非常直接的相关性。近年来关于蛋白质超二级结构的研究已经成为国际上的一个研究热点。（二）蛋白质的结构域 是指在超二级结构基础上组装而成的，多肽链折叠成近乎球状的组装体，这种相对独立的三维实体叫结构域。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。 蛋白质三级结构的基本结构单位是结构域。一个蛋白质可以只包含一个结构域也可以由几个结构域组成，故结构域是能够独立折叠为稳定的三级结构的多肽链的一部分或全部。 由于结构域往往是蛋白质中具有进化保守性的一段氨基酸序列，同时也是蛋白质分子相互作用过程中发挥重要作用的结构和功能区域，结构域信息对于预测蛋白质间相互作用具有重要的价值。六、蛋白质空间结构的折叠 蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，若蛋白质进行错误折叠形成非天然构象，并相互聚集，这些聚集体不仅丧失了原有的蛋白质功能，还对细胞有一定的毒性。这种由分子构象改变所引起的疾病称为“构象病”或“折叠病”。“疯牛病”“克雅二氏病”1985年4月，医学家们在英国发现了一种新病，专家们对这一世界始发病例进行组织病理学检查。10年来，这种病迅速蔓延，英国每年有成千上万头牛因患这种病导致神经错乱、痴呆，不久死亡。学家们发现BSE的病程一般为1490天，潜伏期长达46年。这种病多发生在4岁左右的成年牛身上。其症状不尽相同，多数病牛中枢神经系统出现变化，行为反常，烦躁不安，对声音和触摸，尤其是对头部触摸过分敏感，步态不稳，经常乱踢以至摔倒、抽搐，以至死亡。经解剖发现，病牛中枢神经系统的脑灰质部分形成海绵状空泡，脑干灰质两侧呈对称性病变，神经纤维网有中等数量的不连续的卵形和球形空洞，神经细胞肿胀成气球状，细胞质变窄。另外，还有明显的神经细胞变性及坏死。 目前研究发现，有20多种疾病的发生与蛋白质分子构象错误相关，如成骨不全症、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白、某些肿瘤、白内障等都属于蛋白质“折叠病”。都是相关蛋白质的三维空间结构异常并通过分子间作用感染正常蛋白质而造成。蛋白质分子主要通过两种模式完成折叠过程，即自发的层次性折叠和依赖其他蛋白质的折叠。许多小分子蛋白质采取自发的分层性折叠模式完成折叠过程，即首先在局部形成正确的二级结构，然后进一步组装形成超二级结构或结构域，最后再形成完整的构象。大分子蛋白质的折叠过程需要其他蛋白质或酶的协助才能完成折叠。参与蛋白质分子折叠过程的蛋白质或酶主要有三类：分子伴侣蛋白质二硫键异构酶肽酰脯氨酰顺反异构酶随着基因工程研究的发展，人们发现将外源基因导入大肠杆菌进行表达时，其产物虽具有预定一级结构，但并未形成具生物活性的空间结构。分子伴侣 一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组分。分子伴侣的功能：能特异地识别未折叠蛋白、折叠中间体以及错误折叠蛋白的疏水区，阻止蛋白质形成不溶性、无活性的蛋白质，保证蛋白质的正确折叠。某些特殊的分子伴侣还可以协助已经形成的聚集物重折叠，从而恢复蛋白质的生物活性以及水溶性。对于某些折叠错误的蛋白质，分子伴侣可以通过促进其被降解而尽可能减少聚集物形成。71分子伴侣类型伴侣素家族是具有独特的双层 7-9 元环状结构的寡聚蛋白，它们以依赖 ATP 的方式促进体内正常和应急条件下的蛋白质折叠。应激蛋白70 家族又称为热休克蛋白70 家族（Hsp70 family ），是一类分子量约70Ku 的高度保守的 ATP 酶，广泛地存在于原核和真核细胞中。在细胞应急和非应急条件下的蛋白质代谢，如蛋白质的从头折叠、跨膜运输、错误折叠多肽的降解及其调控过程中有重要的作用。蛋白质二硫键异构酶 在内质网腔中活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确的二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。肽酰脯氨酰顺反异构酶 多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。 肽酰脯氨酰顺反异构酶可促进顺反两种异构体之间的转换，是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，肽酰脯氨酰顺反异构酶可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。只要蛋白质序列足够相似，那么蛋白质结构也是相似的。但并不意味着具有相似结构的蛋白质一定具有相似的序列。存在两个蛋白质序列完全不同，但却具有相似结构的情况。两个从不同进化原点出发的蛋白质，由于趋同进化的作用，可能会折叠成相似的空间结构。因此为了发现具有相似结构的蛋白质，需要在结构水平上比较蛋白质。对蛋白质的比较可以在序列水平上进行也可以在结构水平上进行。蛋白质的结构比序列更加保守，通过比较蛋白质的空间结构，可以发现蛋白质的结构共性，发现属于同一家族蛋白质的保守结构，发现与蛋白质结构功能密切相关的结构域，发现特定的空间结构模式，而这种模式在进行序列分析时无法发现。第三节 蛋白质的重要理化性质蛋白质的胶体性质蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质的变性作用 蛋白质的沉淀作用蛋白质的颜色反应一、蛋白质的胶体性质丁达尔效应、布朗运动，不能透过半透膜(分离）二、蛋白质的两性解离和等电点 调节溶液的pH值，到达一定pH时，蛋白质分子主要以两性离子形式存在，所带正负电荷数相等，其净电荷为零，这时的溶液pH称为蛋白质的等电点，以pI表示 。三、蛋白质的变性作用 天然蛋白质分子受到某些理化因素的作用，有序的空间结构被破坏，导致生物活性丧失，并伴随发生理化性质的异常变化被称为变性作用。蛋白质的变性作用涉及蛋白质二级、三级、四级结构的丧失，但一级结构保持不变，肽键不发生断裂，所以蛋白质变性前后分子量不变。可逆变性：在除去变性因素后可恢复原有的理化性质和生物功能。不可逆变性：即使除去变性因素，蛋白质也无法恢复原有的空间结构和生理活性。 医学上消毒和灭菌，生物制品的保存和制备。变性的因素：分为物理因素和化学因素。物理因素包括：加热、紫外线、超声波、X-射线、高压、表面张力、剧烈振荡、搅拌、研磨，等等。化学因素包括：酸、碱、有机溶剂、重金属盐、变性剂、去污剂、生物碱试剂，等等。 四、蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液在通常情况下虽然比较稳定，但这种稳定性是相对的，需要满足带同种电荷及形成水化层这两个条件，一旦环境条件发生改变破坏了蛋白质分子的表面电荷或水化层，胶体稳定性就会变差，发生絮结沉淀，这就是蛋白质的沉淀作用。常用的蛋白质沉淀试剂中性盐：硫酸铵，盐析法用于分离蛋白有机溶剂：丙酮、乙醇，必须保持低温生物碱试剂：用于尿中蛋白的检查（变性）重金属：误服重金属中毒的病人（变性）热：卵清蛋白pH：酪蛋白：牛奶 pH>PI ；酸奶 pH=PI五、蛋白质的颜色反应双缩脲反应：两分子双缩脲在碱性条件下与碱性CuSO4作用，生成粉红色的复合物，这种反应称为双缩脲反应。随肽链的伸长，显示颜色由粉红色到紫红色、蓝紫色。二肽不具有双缩脲反应。在蛋白质水解过程中，双缩脲反应呈阴性还不能断定蛋白质已完全水解为氨基酸。Folin-酚反应 ： 由于酪氨酸Tyr的酚羟基具有还原性，在碱性条件下，可使Folin-酚试剂（主要成分为磷钼酸和磷钨酸）还原生成蓝色化合物（钼兰和钨兰），此蓝色化合物在680nm处有最大光吸收，利用此反应可测定Tyr含量。蛋白质分子中含有酪氨酸，因此也具有Folin-酚反应，与Folin-酚试剂同样显蓝色。Folin-酚法（又称Lowry法）也是测定蛋白质含量的一种常用方法。第四节 蛋白质的分离纯化一、蛋白质分离纯化的一般步骤： 前处理：抽提粗分级：沉淀细分级：电泳，层析，透析，超滤，结晶电泳（electrophoresis） 在外电场的作用下，带电颗粒将向电性相反的电极移动，这种现象称为电泳，利用这种现象对不同分子进行分离的技术称为电泳技术。原理：不同的蛋白质因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度，从而达到分析和分离蛋白质的目的。分类：根据支持物的不同分为： 薄膜电泳：如醋酸纤维薄膜电泳。 凝胶电泳：支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，两端加上正负电压，蛋白质即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到一条条已被分离的蛋白质色带。常用电泳：SDS-PAGE，2-D电泳。预制胶水平电泳，垂直板电泳（不连续电泳），圆盘电泳（管胶）。透析 将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化。不断更换袋外的水，可把袋内小分子杂质全部去尽。反透析 如果袋外放吸水剂（如聚乙二醇），则袋内水分伴同小分子杂质透出袋外，蛋白质溶液可达到浓缩的目的-反透析。超滤 利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质被膜截留，称为超过滤。此法可用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐及纯化。 层析层析技术的发展 ：俄国植物学家茨维特于1903年首先用层析技术分离植物色素，层析技术又称为色谱法。层析的原理：层析系统包括两个相：固定相和流动相。固定相通过吸附力、亲和力等与样品各组分结合, 流动相分别将各组分从固定相上分离。其依据是各组分的理化性质如分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等不同。层析的分类：吸附层析、离子交换层析、 分子筛层析、亲和层析等。凝胶过滤层析（分子筛层析） 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。 常用的凝胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶。 亲和层析利用能与蛋白质（或其他生物高分子）进行特异结合的配基作为固定相，对混合物中某一蛋白质进行分离纯化的层析技术。通常只需一步处理就可把某一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而且纯度限很高。 固定相：某一酶特定的底物、产物、辅酶、抑制剂、变构调节剂， 某一激素特异的受体；某一抗原特异的抗体；与DNA互补的RNA等。如伴刀豆球蛋白A与葡萄糖有特异的亲和力，借助葡萄糖配基即可分离纯化伴刀豆球蛋白A。超速离心法 蛋白质分子比重略大于水，有下沉/沉降的趋势，但布朗运动又促使蛋白质扩散。欲使蛋白质分子下沉，在特定溶剂中，必须利用超速离心力，速度一般超过80000转/分。 结晶 许多蛋白质经提纯后可在盐溶液或缓冲液中形成结晶。一般只有同种蛋白质分子才能定向聚集形成结晶，因此结晶过程伴有一定程度的提纯。变性蛋白质不能参与晶体的形成，所以蛋白质结晶不仅是纯度的一个标志，也是判断制品处于天然状态的重要指标。二、蛋白质检测定量检测： 280nm比色测定；考马斯亮蓝570nm比色测定；二辛可酸562nm比色测定；双缩脲法比色测定； Lowry法比色测定定性检测： 纯度测定：酶比活，SDS-PAGE，质谱检测，IEF，CE等。 分子量、亚基数目测定：非变性电泳， SDS-PAGE；质谱检测，凝胶过滤层析。 等电点测定： IEF。 活性检测：酶活，体外活性（培养实验，酶联免疫分析），体内活性。 IEF（等电聚焦），CE（毛细管电泳）三、蛋白质保存低温保存：4短期保存，冻存（加甘油等保护剂）。真空冷冻干燥保存：加保护剂后冻干，低温保存。第五节 蛋白质的合成和代谢一、蛋白质的代谢二、蛋白质的合成细胞中蛋白质的合成是一个严格按照mRNA上密码子的信息指导氨基酸单体合成为多肽链的过程，这一过程称为mRNA的翻译。mRNA的翻译需要有mRNA、tRNA、核糖体、多种氨基酸和多种酶等的共同参与。翻译过程(即多肽链的合成)包括起始、多肽链延长和翻译终止3个基本阶段。 细胞中蛋白质的合成是一个严格按照mRNA上密码子的信息指导氨基酸单体合成为多肽链的过程，这一过程称为mRNA的翻译。mRNA的翻译需要有mRNA、tRNA、核糖体、多种氨基酸和多种酶等的共同参与。翻译过程(即多肽链的合成)包括起始、多肽链延长和翻译终止3个基本阶段。在翻译过程中，由于每一个氨基酸是严格按照mRNA模板的密码序列被逐个合成到肽链上，因此，mRNA上的遗传信息被准确地翻译成特定的氨基酸序列。蛋白质合成以后还要经历各种修饰和加工。真核细胞中蛋白质的修饰加工往往在特定的细胞器中进行，例如蛋白质的糖基化需要内质网和高尔基体内酶的作用。一些蛋白如膜蛋白等需要定位在细胞的特定部位才能有特殊的功能。另一些蛋白需要在不同的细胞器之间转运或运转出细胞。 翻译开始时，核糖体小亚基先与mRNA的起始密码（如AUG）部位和一个带有相应反密码子的特定tRNA相结合。接着核糖体大亚基与核糖体小亚基结合，形成完整的核糖体。起始tRNA处于核糖体的P位，下一个氨基酸由相应的氨酰tRNA携带进入到A位。在几种酶即延长因子的作用下，氨酰tRNA上的反密码子与mRNA上相应的密码子按碱基互补的原则以氢键相连。接着A位氨酰tRNA上氨基酸的氨基与P位起始tRNA上甲酰甲硫氨酸的羧基（以后则是P位tRNA肽链的羧基）之间形成肽键，起始tRNA上的甲酰甲硫氨酸（以后则是P位tRNA的肽链）与原来的tRNA脱离并转移到A位tRNA携带的氨基酸上，P位的tRNA同时移入E位，然后脱离核糖体。这时在A位上携带新形成的二肽（以后是多肽链）的tRNA转移到已空出的P位上， A位又可以接受下一个氨酰tRNA，重复进行新一轮氨基酸逐个合成到肽链上的过程。 随着翻译的进行及多肽链的延长，当mRNA上的终止密码子进入到核糖体的A位时，一种肽链释放因子（蛋白酶）便与A位的终止密码子结合，多肽链与P位的tRNA水解分离，合成完毕的多肽链从核糖体中被释放出来，再折叠组装成有功能的蛋白质。 一段mRNA可以相继与多个核糖体结合，同时进行多条同一种肽链的合成。在细胞质中，翻译是一个快速过程。在一个核糖体上一段肽链的合成平均不到1min，且一段mRNA可以相继与多个核糖体结合，同时进行多条同一种肽链的合成。在细胞质中，翻译是一个快速过程，一段mRNA可以相继与多个核糖体结合，同时进行多条同一种肽链的合成。蛋白质合成以后还要经历各种修饰和加工。真核细胞中蛋白质的修饰加工往往在特定的细胞器中进行。奠辜尾撒储扣舞琶囱踏捉躲豆桃盏佳活