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    南京农业大学陈溥言.ppt

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    南京农业大学陈溥言.ppt

    南京农业大学 陈溥言,圆环病毒病,断奶仔猪多系统消耗综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)是一种新的猪传染病,主要侵害6-8周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性体重下降、呼吸道症状及黄疸,造成患猪免疫机能下降、生产性能降低,给养猪业带来了很大的经济损失。该病1991年首次报道于加拿大,而后美国、法国、西班牙、意大利及墨西哥等美洲和欧洲国家相继报道此病的发生。我国中监所郎洪武等证实国内存在此病。最近研究表明PMWS的发生与一种猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的感染有关。,(一) 概况,断奶仔猪多系统消耗综合症,(二 )多病原疾病,PCV-2是PMWS的主要病因,但并不是唯一的病原。PMWS很可能是PCV和PPV、PRRSV等病原混合感染的结果。Alian等(1999)、Kennedy等(2000)、Krakowka等(2000)利用PPV和PCV-2共同感染未经母乳哺育的仔猪或悉生仔猪,成功复制出典型的PMWS症状及病变,但单独使用PCV-2实验感染,只能产生轻微的症状。同时也有学者将PMWS病死猪组织悬液感染仔猪,仔猪出现典型PMWS症状,而且可从病变组织中分享出PCV-2和PPV,血清中可检测到两者的抗体。因此可以认为PPV在PMWS疾病发生中起着重要作用,或者说PMWS就是两者共同感染的结果。 另外,PRRSV可以从一些已感染或正在感染PMWS的猪体内分离到。因此,有人认为PMWS是多病原疾病,可能是PCV与PRRSV、PPV等多种病原混合感染的结果。,(三)PCV致病性及危害 1、PCV可在猪源细胞培养物上繁殖,不产生CPE,易被忽视,因此对猪源细胞疫苗或诊断抗原生产造成潜在的危害。 2、PCV-2多数情况下引起亚临床感染,但如与其他病原如PPV等混合感染或环境应激情况下则可直接发生PMWS。 3、PCV-2的靶细胞 为淋巴细胞,主要是巨噬细胞、B细胞,病毒感染后引起细胞凋亡,使机体免疫抵抗力下降,从而继发感染其他病原体,包括PRRSV、PPV、PRV和猪链球菌等,引起更严重的疾病。,(四)该病主要表现:,侵害:淋巴系统、呼吸道、黄疸 日龄:6-8周龄仔猪 影响:免疫机能下降、生产性能降低、 渐进性体重下降,(五)病原体,猪圆环病毒 2型(PCV-2),圆环病毒有两种血清型:PCV-1和PCV-2,PCV-1基因组全长1759bp;PCV-2为1768bp。两者的基因组核苷酸序序列同源性仅为6875%。 PCV-1、PCV-2都主要包含ORF1、ORF2两个阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白,ORF编码病毒的核衣壳蛋白,具有良好的免疫原性。 PCV-1无致病性,广泛存在猪源细胞及正常猪体内各组织;PCV-2现证明与断奶仔猪多系统消耗综合症(PMWS)、猪皮炎肾病综合症(PDNS)及A2型先天性综合征相关。,PCV-2基因组及编码蛋白示意图,PCV-1与PCV-2,PCV-1:最初是从猪肾传代细胞系PK-15分离到,动物感染试验表明此PCV无致病性。该病毒可长期持续污染PK-15,不产生细胞病变 。 PCV-2:PCV-2是PMWS的主要病因(但不是唯一的病原)。,二、PCV-2毒株的分离鉴定,病料处理(将PCR扩增阳性的组织病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒,如PRRSV) 接种细胞PK-15盲传10代(300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理) 间接免疫荧光实验及电镜观察病毒颗粒,接种病料的PK-15的IIF结果,未接种病料的PK-15的IIF结果,病毒粒子电镜照片,(卢银华),本实验室共分离了5株PCV-2,根据其分离地将其分别命名为shanghai PCV、jiangsu PCV、dengta PCV、qingdao PCV及xiaosan PCV。,超薄切片观察结果(30,000 ),三 复合PCR方法的建立,1、引物设计 引物1(为PCV-1、2共同序列): 5-CCGCGGTGGCTGAACTT-3(PCV-1 nt478-496;PCV-2 nt491-519); 引物2(PCV-1特异序列): 5-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3(PCV-1 nt1108-1129); 引物3(PCV-2特异序列): 5-ACCCCCGCCACGTACC-3(PCV-2 nt1627-1644) 引物1、2扩增的片段长度为652bp( PCV-1 ),引物1、3之间的跨幅为1154bp(PCV-2)。,2、复合PCR方法的初步用,1)对多株猪源传代细胞(包括4株PK-15及1株ST细胞)进行了PCV检测,发现所有细胞均污染有PCV-1,其中一株还扩增出了PCV-2基因片段;,M:DNA分子量标准 DL-2000 1:PK-15(a) 2:PK-15(b) 3:PK-15(c) 4:PK-15(d) 5:ST,1 2 3 4 5 M,1000bp,750bp,1 2 3 4 5 6 7 8 M,9 10 11 12 13 14 15 16 M,2)对38个病例(病猪表现为消瘦、呼吸困难及淋巴结肿大等)的组织(取肺组织)进行PCR扩增。结果发现,9个病例同时存在PCV两种血清型病毒感染,23个病例感染有PCV-2。部分电泳结果见下图。,图中样品1,3-8,10,11,13,15,16均为PCV-2阳性。2,9,14样品PCV-1、PCV2均为阳性。12为PCV-1阳性。,上海、江苏、山东及浙江四个省市猪群中普遍存在PCV感染,其中PCV2感染最为普遍,感染率分别达27.3%、15%、23.1%和48.1%。另外也存在一定程度的PCV1和PCV2的混合感染,感染率分别为18.1%、20%、7.7%及19.2%。,3)病料检测结果,四 分离PCV毒株全基因组序列分析,测序结果表明,5个PCV2分离株基因组全长均为1768bp,与以往资料报道的完全一致。 DNAstar软件分析显示, 本实验的5个毒株内部同源性为95.5%100%,其中ShanghaiPCV及Zhejiang1PCV基因组序列完全相同,而JiangsuPCV与ShandongPCV、Zhejiang2PCV两毒株差异相对较大,同源性仅为95.5%。 所选用的2株PCV-1毒株AF012107、AF071879之间同源性很高,但它们与PCV-2毒株的同源性仅为 76.5-78.3%,4、PCV毒株的系统发生进化树,ShanghaiPCV、Zhejiang1PCV及JiangsuPCV与美国分离株AF264039亲缘关系很近。 ShandongPCV、Zhejiang2PCV与德国分离株AF201311亲缘关系密切。由此说明,我国的PCV2分离株来源广泛。,percentldentity,PCV毒株全基因组的同源性比较,国内不同PCV2毒株基因组序列存在明显差异,从而为我国建立更有针对性的分子生物学诊断检测方法提供了依据。 华东地区PCV2分离株来源较为广泛。 ORF2核苷酸序列变异显著。随着PCV2 ORF2的不断变异可能会出现新的PCV致病型和血清型。 PCV2 ORF2编码蛋白存在2个特异的抗原区域,这为建立PCV2特异的检测方法提供了理论依据。,结 论,PCV的体外培养,PCV体外培养特性与猪细小病毒(PPV)相似,适于在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞上复制,并且PCV的复制依赖细胞周期S期表达的细胞蛋白。Tischer等对猪肾传代细胞系PK-15 PCV培养物用a-氨基葡萄糖处理后可以促进病毒DNA进入细胞核,从而提高病毒复制,试验证明可使PCV抗原阳性的细胞数增加30%。Alian等证明PCV在源于猪骨髓、外周血液、肺洗出物和淋巴结的单核细胞/巨噬细胞中复制。牛外周血液来源的单核细胞也对PCV感染敏感。另有报道,PCV也可在猪睾丸传代细胞系(ST)及vero 细胞上生长。但遗憾的是,迄今为止,PCV在所有细胞上培养时均不产生细胞病变,病毒检测需借助于免疫荧光试验、免疫组化试验、核酸探针及PCR等方法,比较麻烦。,PCV流行病学,PMWS主要侵害6-8周龄的仔猪,一般4-10%的猪发病,这些病猪散在于正常的健康猪中,病死率高达50-100%。成年猪一般为隐性感染,不表现任何症状和病变。此病的一个主要特点是仔猪淋巴系统受损,出现免疫缺隐,因此常常继发感染一些别的疾病,如地方性猪肺疫、多杀性巴氏杆菌及链球菌感染,从而使疾病症状复杂化,难以确定疾病的真正病原。另一特点是发展缓慢,猪群的一次发病可持续12-18月之久,所以猪场所受的经济损失是很明显的。,PCV感染普遍,血清学调查表明,北美和欧洲的猪群中PCV抗体非常普遍,且抗体主要是针对PCV-2.如在德国屠宰场面猪血清中,85%有PCV抗体;在美国进行的一次调查中53%的样品有抗体;在英国随机采集的猪血清样品中86%有PCV抗体;在德国的一次调查中,用ELISA检测发现几乎所有猪群都感染PCV。但令人费解的是,PCV感染如此普遍,厕真正导致PMWS或其他不关疾病的不多,大多为隐性感染或亚临床感染。这部分原因可能是因为仔猪需感染一定数量的PCV-2才能出现临床症状及病变。,环境因素十分重要,现已清楚,PMWS病猪可通过粪便和鼻分泌物排出PCV,引起病毒在不同猪个体之间进行传播。这种病毒在不同猪群之间的传播方式则尚不为所知;猪在不同猪群之间的移动很可能是主要的传播途径。由于这一病毒结构简单,非常能耐受不良环境,所以也可能通过衣服和设备进行传播。鸟类、啮齿动物如鼠等带毒,可能会引起传播。有试验表明,外观正常的公猪精液中可检测到PCV,因此可能存在PMWS病的垂直传播。混群、应激、高密度饲养等因素可诱发仔猪发病。,临床症状和病理变化,该病的主要症状为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白或黄疸、共济失调及突然死亡。剖检后可见,病猪主要发年淋巴结病、间质性肺炎,其它大部分组织也存在病变,包括肝、肾、胰、皮肤和大脑。淋巴结(包括腹股沟、气管支气管及肠系膜等处)明显肿大,严重时体积可为正常的3倍,纵切面呈均匀白色;肺脏无塌陷,呈橡皮样水肿;其他组织都有不同程度的炎症。 显微病变,肺部明显多灶性闭塞性支气管肺炎,肺细胞增生明显,肺泡内含有中性白细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞及纤维性环死碎屑;在集合淋巴结、扁桃体及脾脏等组织淋巴滤泡坏死,淋巴细胞减少及巨噬细胞、多核巨细胞浸润,细胞内有多个球形嗜碱性或两染性胞浆内包涵体,电镜观察可见到包涵体由许多直径约为20nm的电子致密颗粒组成,呈晶格状排列。肠道病变主要是单核细胞浸润和小肠固有层形成合胞体。,发病机理,PMWS的发病机理至今尚不清楚。Rosell等从2个慢性病例的病变发现,PCV2从猪的鼻、口、侵入体内,在扁桃体、局部淋巴结增殖后,向其它淋巴组织、肺、肝、肾扩散。受慢性感染的影响,诱发免疫抑制、肠炎、间质性肾炎及肝损伤。 Shibahara等研究表明PCV感染可诱导B细胞凋亡,从而导致机体免疫功能下降。从这些结果可以看出PCV感染可能干扰正常的免疫功能,从而致使机体抵抗力下降,导致继发感染产生PMWS。 Krakowka等将PCV2感染悉生仔猪后,注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔戚血蓝蛋白,可使PCV感染仔猪出现明显的PMWS症 及病变,而未钥孔戚血蓝蛋白注射的对照组不发生PMWS。 因此,目前认为免疫刺激在PMWS的发病过程中起着关键的作用。综上所述,PMWS的发生原因比较复杂,不仅与感染PCV2有直接关系,而且可能与其它病原如PPV、PRRSV及猪链球菌等的感染或免疫应激密切相关。,防 制,此病没有特异性的控制措施,也无有效的治疗方法。目前无理想的疫苗(主要是病毒滴度低),加上此病程持久对仔猪造成免疫缺陷。因此,要采取对症治疗。 抗生注射和良好的管理,有助于解决继发感染或并发感染的问题,但对此病本身无效。本病的疫苗正处于试验阶段。所以目前要控制此病只能依靠加强日常管理,目标是减轻疾病的压力以及此病的重要诱发因素。,1降低饲养密度; 2实行严格的全进全出制; 3在每一批猪饲养期间以及在各批猪之间都要实验严格的生安全措施。在这些措施中应包括应用有效的消毒剂,现在英国有一种专利消毒剂Virkon在1:250稀释度时能有效杀灭圆环病毒。 4不要将不同来源的猪混群,也不要将不同年龄阶段的猪饲养在同一空间中 5 减少天气应激因子(如温度变化、贼风和有害气体) 6 有效控制鼠类及鸟类等带毒动物 7采用适当的手段(免疫接种、抗 生素治疗和加强管理)控制并发感染; 8 要尽可能保证猪群具有稳定的免疫状态,重要的是要搞好新猪群的隔离和混群,

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