《提取分离》PPT课件.ppt

第二章 天然产物的提取分离 和结构鉴定,一、基本概念 1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所 要成分尽可能从原料中完全提出的过程。 2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分 开，并将得到的单体加以精制的过程。,第一节 天然产物的提取,水 亲水性有机溶剂 亲脂性有机溶剂,二、提取方法,超临界流体萃取法（SFE）,水蒸气蒸馏法,溶剂提取法,升华法,压榨法,溶剂,根据天然成分的溶解性不同， 选用对所需成分溶解度大而对其他 成分溶解度小的溶剂，将所需成分 从生物材料中溶解出来的一种提取方法。,（一）溶剂提取法,溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程。 包括浸润、解吸和扩散三个阶段。,1、溶剂提取法的原理,选择溶剂依据相似相溶原理。,浸润：渗透阶段 溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。,解吸：溶解阶段 细胞内容物与细胞组织之间有亲和 力，溶剂破除这种亲和力。,扩散：置换阶段 利用细胞内的渗透力产生的压差而抽提出来，用溶剂占领内容物的位置而将内容物置换出来。,4、化合物的结构与亲水性、亲脂性的关系 （1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强，反之则亲脂性越强。 （2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。 （3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强，亲脂性越弱。,5、溶剂的选择 (1) 水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。 (2) 亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。 (3) 亲脂性有机溶剂： 具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。 优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。,6、溶剂提取的方法,溶剂提取的方法,连续回流提取法,回流提取法,煎煮法（煎中药）,渗漉法,浸渍法（泡药酒）,以水或稀醇反复提取，适于遇热易破坏或挥发性成分及含淀粉、粘液质较多的材料。,（1）浸渍法,民间的药酒浸制。,（2）渗漉法,以稀乙醇或酸、水作溶剂，先浸后渗，提取效率高于浸渍法。但溶剂用量大，对原料粒度要求高。,实验室简单渗漉装置,（3）煎煮法,以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原料也不适用。,传统的中药煎制。,（4）回流提取法,使用有机溶剂。对遇热易破坏的成分有影响。,（5）连续回流提取法,索式提取器的组成,循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连续提取的方法。 提取效率高，节省溶剂。但不适于热不稳定成分的提取。,也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇。不同比例的溶剂可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等。,索式提取器连续回流提取,萃取瓶 （圆底烧瓶）,冷凝管,脂肪提取器,滤纸筒,虹吸管,蒸汽管,.把滤纸做成与提取器大小相应的滤纸筒，然后把需要提取的样品放入滤纸筒内，装入提取器。 注意: a.滤纸筒既要紧贴器壁，又要方便取放。（滤纸筒上可以套一圈棉线，方便提取完成后取出滤纸筒。） b.被提取物高度不能超过虹吸管，否则被提取物不能被溶剂充分浸泡，影响提取效果。被提取物亦不能漏出滤纸筒，以免堵塞虹吸管。如果试样较轻，可以用脱脂棉压住试样。,操作步骤：,.在提取用的烧瓶中加入提取溶剂和沸石（没有沸石可以用玻璃珠或碎瓷片，目的就是防止暴沸）。,.连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水,加热。沸腾后，溶剂的蒸气从烧瓶进到冷凝管中，冷凝后的溶剂回流到滤纸筒中，浸取样品。溶剂在提取器内到达一定的高度时，就携带所提取的物质一同从侧面的虹吸管流入烧瓶中。溶剂就这样在仪器内循环流动，把所要提取的物质集中到下面的烧瓶内。,具体的回流时间是不一样的，有的是按文献要求提取一定时间，有的是提取至提取液无色，又比如用乙醚提取样品中的脂肪时是以抽提管中流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。总之就是要提取完全为止。,7、影响溶剂提取法的因素,（1）生物材料的粉碎度,材料细，面积大，扩散快，效果好。但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提取。 花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细些。,（2）提取温度,一般使用常温，在不破坏有效成分的条件下加热不要超过80C。 温度低提取时的杂质少，温度高时提取效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水提时避免热提。,（3）提取时间,以提完为准，是否完全可以提取也做定性实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断。,根据检测结果确定是否需要延长提取时间。,（4）浓度差,根据扩散原理，造成提取液的浓度差可以提高提取的效率。,可采取的措施有：搅拌、更换溶剂。,（5）新技术的使用,超声波、微波促提技术的应用，可以加快提取速度，提高提取效率。,目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率（3300W）来提高萃取效率。但较大的超声波功率，又会发出令人感觉不适的噪音。,超声波促提原理：,为物理过程，无化学反应，不改变生物活性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、扩散、溶解。,实验室用小型超声仪,工业生产用超声仪,微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物从固相进入溶剂相的过程。,微波促提原理：,具有穿透力强，加热效率高，操作简便、快速、节能、高效等特点。 缺点：化学成分的结构易发生变化，继而导致生物活性的改变。,微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物质的稳定性。,工业生产用微波提取罐,（二）水蒸气蒸馏法,适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分结构的提取。如挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。,水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶于水但有一定挥发性的有机物质中，使该 有机物在低于100 的温度下，随着水蒸气一起蒸馏出来。,原理：道尔顿分压定律,水蒸气蒸馏装置,常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、蒸馏、冷凝和接受器四个部分。,磨口玻璃装置,在实验上较为方便，常用于微量实验。操作时将盛有被蒸馏物的烧瓶中加入适量蒸馏水，加热至沸以便产生蒸气，水蒸气与被蒸馏物一起蒸出。对于挥发性液体和数量较少的物料，此法非常适用。,水蒸气蒸馏的方法分为直接法和间接法两种。,直接法,常量实验中经常使用的方法，其操作相对比较复杂，需要安装水蒸气发生器。 图中A是水蒸气发生器，一般使用厚壁玻璃瓶，也可使用金属制成的水蒸气发生器，安全玻璃管B几乎插到发生器A的底部。当容器内气压太大时，水可沿着玻璃管上升，以调节内压。,间接法,蒸馏部分可用三口烧瓶，瓶内液体不宜超过其容积的1/3。蒸气导入管E的末端正对瓶底中央并伸到接近瓶底23 mm处。馏液通过接液管进入接收器，接收器外围可用冷水浴冷却。,水蒸气发生器与盛物的圆底烧瓶之间应装上一个T形管C。在T形管下端连一个带螺旋夹的胶管或两通活塞D，以便及时除去冷凝下来的水滴，应尽量缩短水蒸气发生器与圆底烧瓶之间距离，以减少水气的冷凝。,进行水蒸气蒸馏时，先将被蒸溶液置于三颈瓶中，加热水蒸气发生器A，直至接近沸腾后再关闭两通活塞，使水蒸气均匀地进入圆底烧瓶。 为了使蒸气不致在D中冷凝而积聚过多，必要时可在F下置一石棉网，用小火加热。必须控制加热速度，使蒸气能全部在冷凝管中冷凝下来。,如果随水蒸气挥发的物质具有较高的熔点，在冷凝后易析出固体，则应调小冷凝水的流速，使它冷凝后仍然保持液态。假如已有固体析出，并且接近阻塞时，可暂时停止冷凝水或将冷凝水暂时放去，以使物质熔融后随水流入接收器中。当冷凝管夹套中要重新通入冷却水时，要小心而缓慢，以免冷凝管因骤冷而破裂。万一冷凝管已被阻塞，应立即停止蒸馏，并设法疏通（可用玻棒将阻塞的晶体捅出或用电吹风的热风吹化结晶，也可在冷凝管夹套中灌以热水使之熔化后流出来）。,在蒸馏需要中断或蒸馏完毕后，一定要先打开螺旋夹使通大气，然后方可停止加热，否则蒸馏瓶中的液体将会倒吸到A中。在蒸馏过程中，如发现安全管B中的水位迅速上升，则表示系统中发生了堵塞。此时应立即打开活塞，然后移去热源。待排除了堵塞后再继续进行水蒸气蒸馏。,最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。,（三）超临界流体萃取法,超临界二氧化碳流体(SFE-CO2)临界点(31.1)相当接近室温,利用超临界条件下流体的特殊性能对样品进行提取，是20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。,超临界流体不但具有与液体接近的密度，有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率越高。,常用的超临界流体有CO2、乙烷、丙烷等。,CO2的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）分别为31.05和7.38MPa，当处于这个临界点以上时，此时的CO2同时具有气体和液体双重特性。它既近似于气体，粘度与气体相近；又近似于液体，密度与液体相近，但其扩散系数却比液体大得多。是一个优良的溶剂，能通过分子间的相互作用和扩散作用将许多物质溶解。同时，在稍高于临界点的区域内，压力稍有变化，即引起其密度的很大变化，从而引起溶解度的较大变化。因此，超临界CO2可以从基体中将物质溶解出来，形成超临界CO2负载相，然后降低载气的压力或升高温度，超临界CO2的溶解度降低，这些物质就沉淀出来（解析）与CO2分离，从而达到提取分离的目的。不同的物质由于在CO2中的溶解度不同或同一物质在不同的压力和温度下溶解状况不同，使这种提取分离过程具有较高的选择性。,与普通有机溶剂提取法相比，超临界CO2萃取技术具有无毒、常温、不易燃、无污染等特点，可确保原有的色、香、味不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程中可同时对萃取物进行分离纯化。该技术适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分。,超临界CO2提取的特点。,CO2,钢瓶,冷温槽,高压泵,恒 温 箱,控温面板,接受瓶,流量计,CO2,原料,玻璃珠,脱脂棉,萃取柱,超临界CO2 萃取实验装置示意图,液体CO2由高压泵加压到萃取工艺要求的压力并传送到换热器，将CO2流体加温到萃取工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过程。负载溶质的CO2流体在分离器中改变温度压力，溶解度降低使萃取物得以分离。分离萃取物后的CO2流体再经换热器液化后回到储罐中循环使用。,超临界CO2提取操作流程,20世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青。 70、80年代SFE用于食品香料的提取。 90年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分。,（四）升华法,将固体物质受热气化，遇冷又凝结为固体的方法。,樟木中的樟脑，茶叶中的咖啡因的提取。,2-莰酮,咖啡因,1、将茶叶与95%乙醇回流2h； 2、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积； 3、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份； 4、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗； 5、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色咖啡因在滤纸上结晶。,实验室提取咖啡因步骤：,升 华,借助机械外力的作用，将油脂从榨料中挤压出来的过程。在压榨过程中，主要发生的是物理变化，如物料变形、油脂分离、摩擦发热、水分蒸发等。但由于温度、水分、微生物等的影响，同时也会产生某些生物化学方面的变化，如蛋白质变性、酶的钝化和破坏、某些物质的结合等。压榨时，榨料粒子在压力作用下内外表面相互挤紧，致使其液体部分和凝胶部分分别产生两个不同过程，即油脂从榨料空隙中被挤压出来及榨料粒子变形形成坚硬的油饼。,（五）压榨法,第二节 天然产物的分离与精制,一、溶剂萃取法,1、溶剂分离法,2、两相溶剂萃取法,1、溶剂分离法,采用三、四种不同极性的溶剂，由低级性到高级性分步进行分离。,正己烷乙醚甲醇水,正己烷二氯甲烷甲醇水,一般极性顺序（低到高）： 石油醚CS2CCl4HCCl2CH2Cl苯CH2Cl2CHCl3乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇乙腈水吡啶乙酸,1) 影响分离的因素,分离因子，分配系数K,=Ka/Kb， KaKb,K=CU/CL,CU、CL为被分离物质在上相和下相中浓度,2、两相溶剂萃取法,利用混和物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。,根据值的大小可决定分离采用的方法,100, 简单的一次萃取，可基本分离。 10，数次乃至10余次萃取，CCD法 2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法 1，不能分离,可以根据PC法计算值，选择理想的分离条件。,纸色谱（PC），也叫纸分配色谱（PPC，Paper Partition Chromatography）,(为纸色谱定数),Rfa、Rfb为A、B两物质在PC上的Rf值,pH值,对于酸性、碱性和两性化合物，pH值可以改变它们的存在状态（游离型、解离型），分配比受pH的影响。,HA + H2O = A- + H3O+,pKa= pH - logA-/HA pH = pKa + logA-/HA HA达到99%解离时，pH = pKa + 2 HA达到99%游离时，pH = pKa - 2,2) 酸碱性成分的分离-pH梯度萃取法,按酸碱性强弱的不同分离酸性、碱性、中性物质，改变pH值使酸碱成分呈不同状态。,如中药大黄中的大黄酸、大黄素和大黄酚的分离,大黄酸,大黄素,大黄酚,酸性最强,酸性其次,酸性最弱,溶于NaHCO3,溶于Na2CO3,溶于NaOH,3) 几种逆流分配方法,逆流分溶法,液滴逆流色谱,高速逆流色谱,逆流分溶法（CCD法）,多次连续液-液萃取分离过程 特点：条件温和，样品易回收，适用于中等极性、不稳定物质的分离。,实验室萃取设备： 1、分液漏斗 2、克雷格逆流分布仪。,克雷格逆流分布仪,把一系列的分液漏斗有效地排成链，重复进行系列的步骤：振摇（混合）、静置、分离，多次重复，以提高分离的塔板数。,液滴逆流色谱（DCCC）,液液分配色谱，流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相，实现物质的逆流色谱分配。 特点：不易乳化，样品可定量回收，分离效果好，特别适合于分离皂苷等水溶性成分。 缺点：样品处理量小。,液滴逆流色谱,高速逆流色谱（HSCCC）,通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力场作用，使无载体支持的液体固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单向、低速通过固定相，实现连续逆流萃取分离物质的目的。,用于各种物质的分离，包括蛋白质、酶、三萜、生物碱、皂苷等。,4) 液-液分配柱色谱,正向色谱,固定相极性大，如水、缓冲液等； 流动相极性小，如氯仿、乙酸乙酯等 载体：硅胶（含水一般大于17%），硅藻土、纤维素等。 分离极性较大或水溶性成分，如苷类、糖、生物碱等。 洗脱顺序：极性小的物质先被洗脱出来。,4) 液-液分配柱色谱,固定相极性小于流动相，如HPLC反相色谱柱、反相薄层色谱板。 固定相：硅胶的硅醇基与烷基结合，如RP-2、RP-8、RP-18，亲脂性：RP-18 RP-8 RP-2 流动相（洗脱剂）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O 洗脱顺序：分离极性大的成分，极性大者先被洗脱出来。,反相色谱：,HPLC,三、根据物质的吸附性差别进行分离-吸附色谱法,1、吸附分类,物理吸附：无选择性吸附，吸附-解吸附发生迅速，吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等； 化学吸附：不可逆吸附，如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附；酸性硅胶对生物碱的吸附等； 半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。,吸附原理：相似相吸,影响吸附过程的三要素： 吸附剂（固定相） 溶质（被分离物质） 溶剂（洗脱剂、展开剂、流动相）,2、硅胶、氧化铝,极性吸附剂：载样量大，吸附力强 硅胶：有中性、酸性之分，适用于各类成分分离。 氧化铝：有中性、酸性、碱性之分，不适合于分离酸性成分，多用于分离生物碱。,2、硅胶、氧化铝,被分离物质吸附力与结构的关系,被分离物质极性大，吸附力强，难洗脱，Rf值小。,官能团极性大小排列顺序： -COOH Ar-OH R-OH R-NH2、RNHR、RNRR RCONRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH,2、硅胶、氧化铝,溶剂（洗脱剂）的极性与 洗脱力的关系洗脱剂极性越大， 洗脱力越强；,例：从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分，根据极性大小推测从硅胶柱上的洗脱顺序。,单乙酰黄夹次苷B R = COCH3 , 其它R = H,答案： 1：极性大极性小，黄夹苷A 黄夹苷B 黄夹次苷D 黄夹次苷C 黄夹次苷A 黄夹次苷B 单乙酰黄夹次苷B 2：从硅胶柱上被洗脱下来的顺序：极性小的先被洗出，极性大的后被洗出。,3、 活性炭-非极性吸附剂,吸附力与结构的关系,分子量大者 分子量小者 芳香族 脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的缘故。 含OH、COOH、NH2多者 少者,3、活性炭-非极性吸附剂,溶剂的洗脱力,吡啶 15%酚/醇 7%酚/H2O 醇 含水醇 H2O,黄酮、生物碱的富集，糖的分离，脱色等。,应用,4、聚酰胺（Polyamide）,由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。,分离原理：主要通过酰胺与酚、酸、醌等化合物形成氢键，吸附能力取决于氢键的强弱。,4、聚酰胺,吸附能力与化合物结构的关系,a.形成氢键的基团数目越多，吸附力越强；,4、聚酰胺,b.形成分子内氢键者，吸附力减弱；,c.分子中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，则减弱；,4、聚酰胺,溶剂洗脱能力强弱,尿素水溶液 二甲基甲酰胺 甲酰胺 NaOH水溶液 丙酮 甲醇 水,聚酰胺色谱的应用,4、聚酰胺,聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的（鞣质例外），分离效果好，吸附容量大，特别适合于该类物质的制备与分离。 也可用于生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离； 聚酰胺对鞣质的吸附特别强，近乎不可逆，特别适合于植物粗提物的脱鞣处理。,二、沉淀法,在提取液中加入某些溶剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法 。,1、乙醇沉淀法,2、酸碱沉淀法,3、铅盐沉淀法,提取液中的有效成分在乙醇中不溶或溶解度小。 如：淀粉、树胶、蛋白质、某些多糖。,1、乙醇沉淀法,特别适合于多糖的分离多糖。,如：内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐而溶于水，酸化又析出。,2、酸碱沉淀法,利用某些成分在酸（或碱）中溶解，又在碱（或酸）中沉淀的性质达到分离的方法。,蛔蒿中提取驱蛔有效成分山道年,蛔蒿粉末用石灰乳调匀，加热水提取，山道年成为山道年酸钙被水提出，水提取液过滤浓缩后，加酸酸化，山道年沉淀析出，滤集，用乙酸重结晶可得纯品。,生物碱不溶于水，遇酸生成盐而溶于水，碱化又重新生成游离生物碱。,生物碱沉淀剂可形成不溶性复盐而析出。如雷氏铵盐NH4Cr(NH3)2(SCN)4 陈皮甙，黄芩甙等均可用酸碱沉淀法制备。,R=葡萄糖醛酸,3、铅盐沉淀法,中性Pb(Ac)2或Pb(OH)Ac在水或稀醇中，能与多种成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，利用此性质使有效成分与杂质分离。,中性醋酸铅可沉淀：有机酸、蛋白质、氨基酸、鞣质、树脂、酸性皂甙等。,碱性醋酸铅可沉淀除上述外，另加醇性羟基、酮基、醛基、中性皂甙、异黄酮、糖类。,将铅盐悬浮于新溶剂中，通入H2S，使其分解为PbS，得有效成分。 也可用H2SO4、Na2SO4、H3PO4、Na3PO4脱铅。,脱铅,三、盐析法,在有效成分提取液中，加入无机盐使溶解至一定浓度或达饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低，析出沉淀与水溶性大的杂质分离。,常用盐：NaCl、Na2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4,例：三七水提取液中，加MgSO4到饱和状态， 三七皂甙即可沉淀析出。,三颗针中提取黄连素，加NaCl饱和，小薜碱粗品析出。,四、透析法,利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子则不能通过半透膜的性质进行分离的方法。,如分离纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等大分子时，用此法可除无机盐、单、双糖等小分子杂质 。,透析膜的膜孔有大有小，视具体情况而选择，常用透析膜：动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、玻璃纸膜等。,（1）杂质的除去：天然产物经过提取分离所得到的成分，大多仍然含有杂质，或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在，也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时，必须注意杂质的干扰，应力求尽可能除去。 （2）溶剂的选择：制备结晶，要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂，最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜太高。,五、结晶、重结晶和分步结晶 结晶是利用温度不同引起溶解度的改变而使有效成分 以晶体的形式析出以达到分离物质的目的。,（3）结晶溶液的制备 ：制备结晶的溶液，需要成 为过饱和的溶液。,（4）制备结晶操作,（5）重结晶及分步结晶：晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。,（6）结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一可以作为鉴定的初步依据。,六、层析法,1、柱层析,2、薄层层析,3、纸层析,4、凝胶层析 （又称凝胶过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析等）,2、 薄层层析,前沿,原点,l0,4、凝胶层析 （Gel Penetration Chromatography, GPC）, 葡聚糖凝胶,交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂（一般为环氧氯丙烷）以醚桥的形式互相交联形成的三维空间网状结构高分子材料，是水不溶性的白色球状颗粒，酸性环境能水解，碱中稳定。,在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经路径的不同，使不同相对分子量的组分得以分离的方法。,表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂的配比及反应条件。,商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示，英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量为每克2.5ml。,交联度大网状结构越紧密孔隙越小吸水膨胀越少。,凝胶的型号与使用范围,层析原理,绝大部分在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当溶剂中浸泡，待充分膨胀后装入层析柱，加样后用同一溶液洗脱。在洗脱过程中，较小的分子渗入凝胶，较大的分子随溶液流动，分子量小的物质（阻滞作用大）可通过凝胶网孔进入粒子内部，然后扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出色谱柱，分子量大的物质沉凝胶粒子间孔隙，随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出色谱柱。,不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离 。,1、气相色谱 2、液相色谱 3、制备色谱,八、仪器,气相色谱仪的原理和结构,第三节 天然产物的鉴定,鉴定天然产物所需做的工作 1、元素分析 由哪些元素组成，各占多少。 2、物理常数 熔、沸点 3、比旋光度 4、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定法、MS等方法 5、结构测定法：红外光谱、核磁共振（13C谱 、1H谱和二维谱）,初步推断化合物类型,测定分子式,结构分析,结构验证,确定分子主体结构,测定物理常数，进行鉴别反应，文献调研。,元素分析，分子量测定,UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS,综合分析，化学沟通,CD、ORD、2D-NMR、X-射线衍射,一、结构研究的主要程序,二、结构研究的主要方法,（一）紫外光谱,有机分子吸收紫外光（200400nm）后产生电子跃迁而形成的吸收光谱。,特征参数：max ，（E）,（一）紫外光谱,应用：,推断化合物骨架类型：共轭体系 定量测定：Beer定律,（二）红外光谱,有机分子吸收红外光后产生振动能级跃迁，伴随着转动能级跃迁而形成的吸收光谱。,特征参数：（cm-1),(三）核磁共振波谱 (NMR),原子核在磁场中吸收一定频率的无线电波（60cm-300m）而发生核自旋能级跃迁的现象，称为核磁共振。 核磁共振信号强度对照射频率（或磁场强度）作图，所得图谱称为核磁共振波谱。,苯丙酮,1、核磁共振基本原理,原子核是带正电的微粒（由质子 +中子组成），大多数原子核都具有自旋现象。原子核自旋产生核磁矩，其方向服从右手法则。,1、核磁共振基本原理,原子核在外磁场的作用下，自旋轴绕回旋轴（磁场轴）进动。,H0,H0,进动频率：, H0,为磁旋比，是核的常数。,1、核磁共振基本原理,在外加磁场的情况下，原子核的核磁矩在磁场中的取向不是任意的。,H0,1、核磁共振基本原理,H0=0,E,H0,1、核磁共振基本原理,h0,共振吸收,能级分裂,E = · ·H0,0,m = -1/2,m = 1/2,a扫场法: 改变H0 b扫频法: 改变0,1、核磁共振基本原理,共振吸收的条件：,实现核磁共振的两种方法：,0 = = ·H0,2、核磁共振氢谱（1H-NMR）,核,H0,2、1H-NMR,由于屏蔽效应，氢核实受场强改变，核的进动频率也相应改变。,不同化学环境的氢核不同，其进动频率也不同。,: 屏蔽常数,=(样 -标）/ 标 · 106(ppm) = (H标 -H样）/ H标 · 106(ppm) 值相对稳定,（1）化学位移,（2）峰面积：以积分曲线高度表示,在氢谱中，积分曲线高度与分子中的总H数相当,（3）偶合与分裂,自旋-自旋偶合：核自旋产生的核磁矩间的相互干扰 自旋-自旋分裂：由自旋偶合引起的共振峰分裂的现象,（3）偶合与分裂,例：,Hb核与外磁场同向，使Ha核实受磁场增加，相当于去屏蔽作用，化学位移增加（峰左移）,Hb核与外磁场反向，使Ha核实受磁场减少，相当于屏蔽作用，化学位移降低（峰右移）,溶液中两种类型的分子几乎相等，因此，Ha核被分裂为两个等高度的峰,（未偶合）, 峰形： 单峰（s） 二重峰（d） 三重峰（t） 四重峰（q） 多重峰（m）,裂分后的小峰数为n+1（n为干扰核的数目）； 小峰的面积（或强度）比以（x+1)n二项式展开后各项前的系数表示； 裂分间的距离为偶合常数（J），用以表示相互干扰的程度，并取决于间隔键的距离。, 裂分规律：, 偶合普遍存在，分裂不一定发生,（4）结构研究,可提供的信息： 质子类型及其化学环境；氢分布；核间关系 缺点： 不能给出不含H基团的信息； 对于含C多的有机物中化学环境相近的烷氢常难鉴别。,2、13C-NMR,13C的信号分裂： H对13C的偶合影响突出，仍遵守N+1律 13C的化学位移： 幅度宽，约200ppm，信号重叠少，易识别。,CH3 CH2 CH C,用的多的是偏共振去偶谱,在13C谱上仅仅显示出直接与C原子相连的1H核造成的裂分。,q t d s,符合N+1律：,（四）质谱（MS）,样品导入 系统,离子源,质量分析器,检测器,记录仪,含各种m/z的离子流,单一m/z 的离子流,应用：,测定分子量 测定分子式：精密质量表 结构解析,（四）质谱（MS）,酚 UV280nm，IR15001600、3300cm-1，溶于NaOH 黄酮 黄色或淡黄结晶，UV240285nm及300400nm各一峰，IR在15001700cm-1有吸收。 皂甙 1H谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号。 香豆素 UV240260nm，IR15001600cm-1，有芳环吸收； 320nm吡喃酮环结构， 1700cm-1附近有不饱和内酯吸收峰 ；1H谱主要为芳香质子信号。,三、中药指纹图谱质量控制,借助计算机、信息及先进的物理、化学技术，将中药的特性和有效成分，采用图谱的形式描绘出来，从而鉴定真伪、辨认优劣、确定其质量和有效性。,红外光谱指纹图谱 高效液相色谱-质谱指纹图谱 气相色谱-质谱指纹图谱 质谱指纹图谱 紫外光谱指纹图谱 X-射线衍射指纹图谱,包括：,柚肉汁提取成分的高效液相色谱指纹图谱,植物药是多种化学成分的混合体，其药效不是单一的组份能说明的，是多种活性组份共同起作用的，因此单一活性组份的测定和评价不能说明中药质量的好坏，而且目前很多检测的指标成分不具唯一性，将西药检测的理念完全应用于中药存在以偏盖全，割离整体作用的问题。,植物药材的质量随产地、气候、生产工艺而不同，建立一种代表性的整体性识别方式，将各种共同的特征用一个图谱表现出来受到重视。,指纹图谱是在某一方面从整体上来确定特定研究对象（如中药材，提取物，饮片，注射液等）组成的一种方法，是一种模糊识辨方式。比较适合于中药这种复杂体系的表征。,但其也有局限性： 1、图谱反映的内容不够全面。 2、图谱与具体的成分结构还有一定的差距。,应用某种实用的方法，找出代表性相对更强的图谱进行表征是指纹图谱研究的重点。,THE END！,