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第七章 氧化还原酶第7章 氧化还原酶（1）（3学时）主要内容：一、过氧化物酶二、多酚氧化酶一、过氧化物酶（PODperoxidase）o 过氧化物酶是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。o 过氧化物酶是由单一肽链与一个铁卟啉辅基结合构成的血红蛋白。多数植物过氧化物酶与碳水化合物结合成为糖基化蛋白。糖蛋白有避免蛋白酶降解和稳定蛋白构象的作用。1过氧化物酶作用方式及分布o 1.1过氧化物酶作用方式 过氧化物酶（供体：过氧化氢 氧化还原酶）催化过氧化氢分解时，同时有氢供体参加。 H2O2+ AH2 2H2O+Ao 1.2过氧化物酶分类 （1 ） 含铁过氧化物酶 正铁血红素过氧化物酶 ：含有正铁血红素 （羟高铁血红素）为辅基，存在于高等植物 、动物和微生物中。 绿过氧化物酶 ：绿过氧化物酶的辅基也含有一个铁原卟啉基团，这类酶存在于动物器官和乳中（乳过氧化氢酶 ）。 （2 ）黄蛋白过氧化物酶：含有黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅基，这类酶存在于微生物 和动物 组织中。 o 1.分布：过氧化氢酶在植物细胞中以两种形式存在：。以可溶形式存在于细胞浆中以结合形式在细胞中与细胞壁或细胞器相结合 辣根是过氧化氢酶最重要的一个来源。辣根中20%的过氧化氢酶（POD）与细胞壁结合，用2mol/L NaCl(高离子强度)才能提取出来。辣根中过氧化物酶活力为569,000单位/g组织（蘑菇仅240单位/g组织）。 2 过氧化物酶在食品加工中的应用（1） 过氧化物酶是果蔬成熟和衰老的指标：如苹果气调贮藏中，过氧化物酶出现两个峰值，一个在呼吸转折（成熟），一个在衰老开始。（2） 过氧化物酶的活力与果蔬产品，特别是非酸性蔬菜在保藏期间形成的不良风味有关。（3）过氧化氢酶属于最耐热的酶类，在果蔬加工中常被当作热处理是否充分的指标。POD的测定方法：方法：将已热处理的原料中抽取样品，横切，随即放入愈创木酚或联苯胺溶液中，然后取出，在切面上滴0.3%H2O2，数分钟后，用愈创木酚处理的样品变为褐色，联苯胺变为深蓝色，说明过氧化氢酶未被破坏，热处理时间不够，如果均不变色，则表示热处理效果良好。3过氧化物酶最适pH和最适温度3.1最适pH过氧化物酶一般都含有多种同功酶，因此最适pH范围较宽。酸性状态，过氧化物酶血红素和蛋白质部分分离，酶蛋白从天然状态转变到可逆变性状态，活力下降，且热稳定性低；在中型和碱性状态，酶处于天然状态，蛋白质结构含螺旋结构，稳定，酸化后螺旋结构破坏，产生结构。如青刀豆：pH5.0-5.4，有可溶态，离子结合，共价结合。3.最适温度差异较大：35-60。n 不同来源的过氧化物酶在最适作用温度上存在着很大的差别。例如，马铃薯和花菜（均浆）中过氧化物酶的最适温度分别为55和3540。4过氧化物酶的热稳定性o 4.1. 热失活概念双向性：POD中含有不同的耐热性质部分，不耐热部分在热处理时很快地失活，而耐热部分在同样的温度缓慢地失活。在88热处理时甜玉米中过氧化物酶的失活 （用邻-苯二胺作为氢体底物测定酶活力）可逆性：经热处理后的酶液在室温或较低温度下保藏，它的活力部分可以再生。例如：辣根过氧化物酶在70 加热1小时后，在30 下再生的酶活力可达到处理前的30-40%，而在50 下不能再生，如再降低到40 时，酶活力又开始提高。o 4.2. 过氧化物酶冷冻增活效应果蔬热烫后，有多少残余活力或再生活力被允许留在被保藏的产品中，残余酶活力在冰冻保藏后，质量比酶完全失活时要高。o 4.3. 非脂肪氧合酶作用在热失活中过氧化物酶分子聚集成寡聚体，分子量增加一倍，这个过程包括酶分子展开和展开的酶分子进一步堆积，血红素基暴露，增加了血红素蛋白非酶催化脂肪氧化的能力，导致不良风味的产生，这一过程非脂肪氧合酶作用（热烫钝化）。o 问题：经热烫的罐装或冷冻蔬菜在保藏期间产生的不良风味的原因？5 影响过氧化物酶热失活的因素o 5.1. 不同来源的POD具有不同的耐热性。一般来说，植物的过氧化物酶活力越高，它的耐热性也越高。n 比如马铃薯和花菜匀浆中的过氧化物酶在95加热10min就完全而不可逆地失活。n 而甘蓝中的过氧化物酶在120加热10min仍然有0.3%活力保存下来。o 5.2. 低水分含量，POD耐热性增加：n 例如：水分含量低于40%时，谷类中过氧化物酶的热稳定性与水分含量成反比。n 对于加工脱水果蔬有重要参考价值。o 5.3. 外加因素：降低pH，增加NaCl浓度。n 以辣根中过氧化物酶为例，加入羟高铁血红素能降低酶的热失活速度(pH 7.0、76)n 而升高温度能提高酶的热失活速度。n 在pH7时酶热失活的速度最低，在pH 4.0和pH10时酶热失活的速度分别提高到8倍和2倍。n 酶失活的初速度正比于NaCl的浓度(pH7.0、NaCl浓度低于0.6mo1L)，n 糖能提高苹果和梨中过氧化物酶的热稳定性。o 5.4. 加热方式：pH确定，T确定，T变长，导致酶失活后可能性变大，HTST易导致酶再生。o 5.5. 结合处理： 微波和离子照射能降低在热烫过程中使酶失活所需的热处理强度。辐射处理o 在采用结合处理时，先使用辐射处理，再使用热处理。辐射时酶分子的聚集和单体的改性而使酶的热稳定性显著降低，且不会出现活力再生（辐射诱导水产生自由基二次进攻的结果）。6 化学试剂对过氧化氢酶的影响6.1. 使POD失活的作用方式：o 与酶结合失活o 作用于底物或产物6.2. 化学试剂种类2.1 SO2和亚硫酸盐：SO2的作用仅仅是破坏H2O2 SO2+ H2O 2H2O+SO3o 0.1-0.15%的焦亚硫酸盐能防止豌豆产生不良风味6.2.2 氰化物、叠氰化物和氟复合物：能与血红素结合，为可逆抑制。6.2.3 表面活性化合物：如单甘脂，卵磷脂等，显著失活。6.2.4 高分子物质：如果胶在pH5.5时，使POD显著失活；pH低，使POD完全失活。果胶的存在还能使POD最适pH从5.5移动至8.0，大多数果胶pH在酸性范围。这在食品加工中很重要。二、 多酚氧化酶 o 多酚氧化酶（邻二酚：氧氧化还原酶；E1,10,3,1）在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。引起食品酶促褐变的主要酶类o 果蔬食品在加工及贮藏过程中存在褐变反应，而褐变的原因有非酶性的和酶性的，多酚氧化酶是引起食品酶促褐变的主要酶类，因此研究多酚氧化酶的特性对制定食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。o 有害：新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。o 有利：红茶生产，苹果浓缩汁除涩o 三要素：底物、O2、酶1多酚氧化酶在自然界的分布o （1）广泛存在于自然界，植物、微生物及动物器官。植物品种不同，含量变化很大。果蔬中以橄榄含量最高。o （2）PPO在植物细胞中分布取决于品种和年龄，果蔬而言还取决成熟度，如线粒体，叶绿体。o （3）PPO在果蔬的不同部分含量存在很大差异。大多数水果中PPO以结合状态存在。葡萄皮中PPO活力高，葡萄成熟时PPO活力下降幅度最大。2多酚氧化酶催化的反应及其作用底物o 2.1.催化反应：两类反应都需要有分子氧参加。 (1) 一元酚羟基化：蘑菇中单酚。 (2) 邻二酚氧化，生成邻醌。多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻醌将继续变化。相互作用生成高分子量聚合物。与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物。氧化哪些氧化还原电位较低的化合物，生成无色化合物。 n 其中导致褐色素的生成，反应的产物是无色的。2.2.作用底物2.2.1果蔬中四类 儿茶素 3,4二羟基肉桂酸酯 3,4二羟基苯丙氨酸 酪氨酸2.2.2特点o PPO的最佳底物并非和酶同时存在于同一植物中。o PPO只能催化在对位上有一个大于CH2的取代基的一元酚羟基化，即PPO对底物具有特异性要求。o 不同的品种果蔬，同一品种不同部位中PPO具有不同的底物特性。o 多酚氧化酶在植株幼嫩阶段及生长旺盛期活性最高。3 pH对多酚氧化酶活力的影响o PPO的最适pH4-7之间波动。o 不同种类，同一种果蔬不同品种的PPO，具不同最适pH。o 不同部位，pH也有差异。o 酶的提取或分离方法对最适pH也有影响。o 测定酶活力时，采用的底物和缓冲液对酶最适pH有影响。o 用同工酶，PPO具有一个最适pH外，尚有第二个最适pH。4 温度对多酚氧化酶活力的影响o 酶活力最适温度逐步提高降低，如桃中PPO，从3开始随温度升高，至37最高，后下降。o 不同底物表现出不同的PPO酶活力最适温度：如马铃薯，底物为儿茶素，最适温度22。底物为焦醅酚，最适温度1535，线性上升。o 热失活温度70-90/短时间。o 低温状态酶失活是可逆的。微量的多酚氧化酶也能导致果蔬褐变，冷冻食品生产中热处理是必要的。5多酚氧化酶抑制效应酶促褐变三因素：酶，底物，O2。（1）对酶的抑制：o PPO以铜为辅基的金属蛋白，金属螯合物，如抗坏血酸、柠檬酸、EDTA、果胶、氰化物。（2）与酶催化生成的反应产物作用 同邻二酚氧化产物醌作用的还原剂，如抗坏血酸、SO2、偏重亚硫酸盐。 醌偶合剂：与醌作用，生成稳定的无色化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽、SO2、偏重亚硫酸盐。（3）清除酶作用的底物o 与酚类底物作用的化合物：n PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）与酚强烈缔合，消去底物。（无甲醛啤酒的生产）o 隔氧（4） 热烫处理（灭酶）6光照强度与多酚氧化酶活性 多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统，光照明显促进了此酶的活性。不同光照条件下海带体内酚类化合物含量的结果表明，在01200 Lx(勒克斯)间，PPO随光照强度增加而呈上升趋势。在对玫瑰组织培养的研究中，采用不同的遮光处理(对照、单层膜、双层膜)，其结果也同样证明在一定的光照强度变化幅度内，PPO活性和接种后的褐变率均随光强增加而上升。另外在茶叶研究中也有与此相一致的报道。7 多酚氧化酶的激活剂 o 多酚氧化酶的作用会导致食品褐变。长期以来，防止食品的酶促褐变是一个重要的研究课题。食品界在多酚氧化酶的抑制剂方面作了很多的研究工作，而对于它的激活剂相对地了解较少。o 阴离子洗涤剂，例如SDS (十二烷基磺酸钠) ，能有效激活多酚氧化酶。若苹果经PVP(聚乙烯毗咯烷酮)处理，其果皮的多酚氧化酶便会失活，但用SDS处理后又能将已失活的酶激活。SDS能激活以潜在的形式存在于粗提取液中的多酚氧化酶。o 若用酸或脲素短时间地处理葡萄中的多酚氧化酶，能使酶可逆地激活；如果用酸处理作用时间较长，会导致酶不可逆地激活。另外Cu2+和底物3，4二羟基苯丙氨酸对一些果蔬来源的多酚氧化酶也有激活作用。8 多酚氧化酶在果品和蔬菜中的生理作用o （1）起氧的缓冲剂作用；o （2）为抵抗病原菌提供一定程度的保护作用（因为PPO反应产物的反应能力大）；o （3）酚类物质氧化产物与细胞成份的相互作用，使组织不易受病虫害侵噬；o （4）酶活性的降低标志果实达成熟阶段，适口性增加，种子积累开始。谢谢第7章 氧化还原酶（2）主要内容： 三、 脂肪氧合酶 四、葡萄糖氧化酶 五、超氧化物歧化酶三、 脂肪氧合酶（lipoxygenase, LOX）o 脂肪氧合酶（亚油酸：氧 氧化还原酶；EC 1.13.1.13）是近20年发现的与植物代谢有密切关系的一种酶，它属于氧化还原酶属的范畴，广泛存在于植物体中。研究认为，它可能参与植物生长、发育、成熟、衰老的各个过程，特别是成熟衰老过程中自由基的产生以及乙烯的生物合成，都发现有脂氧合酶的参与。因此脂肪氧合酶被认为是引起机体衰老的一类重要的酶。o 虽然在动物组织中发现了类似于脂肪氧合酶的作用，但是，到目前为止，还没有分离出和脂肪氧合酶类似的酶，动物组织中脂肪的氧化主要是于血红素蛋白质的作用，后者是存在于动物组织中有效的脂肪氧化因素。1 脂肪氧合酶催化的反应 o 脂肪氧合酶对于它作用的底物具有特异性的要求，含有顺，顺1，4戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇都有可能作为脂肪氧合酶的底物。o 最普通的底物是必需脂肪酸：n 亚油酸 o CH3（CH2）4CHCHCH2CHCH(CH2)7COOH n 亚麻酸o CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH n 花生四烯酸o CH3(CH2)4(CH=CH-CH2)4(CH2)2COOH o 顺，顺1，4戊二烯单位的亚甲基在8位的脂肪酸异构体（亚油酸）是脂肪氧合酶的最佳底物。在3位增加一个顺双键并不影响脂肪氧合酶对底物的作用，例如亚麻酸是脂肪氧合酶的良好底物。在脂肪酸的10位和羧基之间增加双键仍然可以作为脂肪氧合酶的底物，例如花生四烯酸(5，8，11，1420四烯酸)和8，11，1420三烯酸都是脂肪氧合酶的底物。脂肪氧合酶作用于亚油酸时，能产生亚油酸的13L和9D氢过氧化物衍生物。2 脂肪氧合酶作用的初期产物的进一步变化 o 如果将氢过氧化亚油酸看作为脂肪氧合酶的初期产物，那么它进一步变化的产物将十分复杂的，氢过氧化亚油酸变化的可能途径，它们包括：n 氢过氧化亚油酸的还原，过氧化物酶体系参与这类反应；n 酶催化氢过氧化亚油酸异构化成多羟基衍生物和酮：n 氢过氧化亚油酸的环氧化，这类反应发生在面粉水悬浊液体系之中；n 马铃薯中的酶催化氢过氧化亚油酸生成乙烯醚；n 在无氧条件下，脂肪氧合酶催化氢过氧化亚油酸和亚油酸发生二聚化反应，同时生成戊烷和氧代二烯酸等产物；n 氢过氧化亚油酸分解生成挥发性的醛和酮，是否有一种特殊的“裂解酶”参与这类反应还没有确定。o 氢过氧化亚油酸通过上述各种途径可以产生数以百计的不同产物，因此，同一种脂肪氧合酶能同时以合乎需要和不合乎需要的方式影响食品的质量，其中一些产物不会影响食品的感官质量，它们的生成，从某种意义上讲，通过竞争减少了另一些有损于食品感官质量的产物的生成。o 除了上述六种途径外，氢过氧化亚油酸还能与食品中非脂肪成分作用，从而进一步影响食品的质量。3 pH对脂肪氧合酶作用的影响o 脂肪氧合酶的最适pH一般在7.08.0，曲线呈钟形，曲线的最高点相当于pH7.08.0，然而，在pH低于7时，酶活力下降的部分原因是脂肪氧合酶的底物亚油酸的溶解度下降的结果，在酸性pH范围内亚油酸实际上是不溶解的，图7-2指出了表面活性剂吐温20对大豆脂肪氧合酶活力pH曲线的影响。4 脂肪氧合酶的作用对食品质量的影响 o 食品的质量取决于它的色、香、味。质构和营养价值。脂肪氧合酶的作用对食品质量的影响比较复杂，它既有助于提高一些质量指标，又能损害另一些质量指标。4.1 脂肪氧合酶的作用对焙烤食品质量的影响 o 脂肪氧合酶在焙烤工业中起着重要的作用。在面包等面制品的生产过程中，添加适量的脂肪酸氧合酶及大豆粉可使面粉中存在的少量不饱和脂肪酸氧化分解，生成具有芳香风味的羰基化合物，从而能改进面粉的颜色和焙烤质量。漂白面粉o 在面粉中加入1%含脂肪氧化酶活力的大豆粉，可改善面粉的颜色和焙烤质量。o 脂肪氧合酶可通过偶合反应导致胡萝卜色素被漂白。强化面筋蛋白o 大豆粉脂肪氧合酶在漂白面粉的同时还具有氧化面筋蛋白质的功能，从而对面团和烘焙食品产生有益的影响。在面粉中加入脂肪和大豆粉后，脂肪经脂肪氧合酶作用所生成的氢过氧化物起着氧化剂的作用。在后者的作用下，面筋蛋白质的巯基(SH)被氧化成SS，这对于强化面团中的蛋白质，即面筋蛋白质的三维网状结构是必要的。改进面包的体积和软度o 脂肪氧合酶还具有另外一个重要功能就是通过面筋蛋白质的氧化，防止脂肪的结合增加面团中游离脂肪的数量，这就保证了外加起酥脂肪能有效地改进面包的体积和软度。在游离脂肪释出时所伴随的面筋蛋白质的氧化，对于改进面团的流变性质是很重要的。在促使面筋蛋白质氧化的过程中，氧化脂肪中间物也起重要的作用。4.2 脂肪氧合酶的作用对于食品颜色、风味和营养的影响 o 脂肪氧合酶作用于不饱和脂肪酸及脂时产生的初期产物，在进一步分解后生成的挥发性化合物对不同的食品的风味产生截然不同的影响。（1）对食品风味的影响n 在一些水果和蔬菜中，例如番茄、豌豆、青刀豆、香蕉和黄瓜，这些挥发性化合物构成了人们期望的风味成分，n 然而在冷冻蔬菜和其他加工食品中，它们却产生了不良的风味。n 在谷类保藏过程中产生的不良风味也与脂肪氧合酶作用的初期产物的进一步分解有关。n 脂肪氧合酶还直接或间接地和肉类酸败及高蛋白质食品的不良风味有关。（2）脂肪氧合酶对食品营养的影响n 它作用的产物对维生素A及维生素A原的破坏；n 它的作用减少了食品中必需不饱和脂肪酸的含量；n 酶作用的产物同蛋白质的必需氨基酸作用，从而降低了蛋白质的营养价值及功能性质。5 脂肪氧合酶的抑制o 脂肪氧合酶会产生两种有害的副作用：一是造成有营养价值的多不饱和脂肪酸损失，二是产生导致酸败的氧化产物；在哺乳动物代谢中它们参与类二十烷酸(如前列腺素)的形成。在加工保藏期间产生不良的风味或导致食品在其他方面的质量的下降，因此，很多情况下，采用各种方法使脂肪氧合酶失活是十分必要的：主要包括控制温度和pH以及使用抗氧化剂。o 控制食品加工时的温度是使脂肪氧合酶失活的最有效手段。例如，在加工豆奶时，将未浸泡的脱壳大豆在加热到80100的热水中研磨10分钟就可以消除不良风味。（康奈尔法）o 将食品材料调节到pH偏酸性再热处理，也是使脂肪氧合酶失活的有效方法。例如，将大豆在pH3.88和水一起研磨，然后再烧煮，能使脂肪氧合酶变性。o 许多研究工作说明，酚类抗氧化剂能抑制脂肪氧合酶。为了避免食品在贮藏中发生酸败，习惯上是添加维生素E或丁羟基茴香醚一类的抗氧化剂来防止脂肪氧化酶的作用。四、 葡萄糖氧化酶（GOD）Glucose Oxidase，简称GOD，-D-葡萄糖：氧化 氧化还原酶；EC1.1.3.4）是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。o 1928年由Muller首先从黑曲霉（Aspergillus niger）的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶。随后Kusai等、Pazur和Swobod-da等分别从青霉素（P.Variable）和黑曲霉中提纯葡萄糖氧化酶。其他霉菌，象米曲霉和点青霉也能产生葡萄糖氧化酶，然而在高等植物和动物体内还没有发现葡萄糖氧化酶。o 葡萄糖氧化酶现已从多种材料中提取纯化予以结晶，并广泛应用于食品、医药、临床化学和分析化学等许多领域中。1 葡萄糖氧化酶催化的反应o 葡萄糖氧化酶的催化反应，按条件不同有如下三种形式：n 在没有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克分子氧。C6H12O6 + O2 C6H12O7 + H2O2o 在有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克原子氧。C6H12O6 + 1/2O2 C6H12O7o 在有乙醇和过氧化氢酶存在下，过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用，此时，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克分子氧。C6H12O6 + C2H5OH + O2 C6H12O7 + CH3CHO + H2O1.1 葡萄糖氧化酶的催化特异性o 葡萄糖氧化酶与其他大多数酶一样，特异性非常严格。它对-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。葡萄糖氧化酶底物分子C（1）上的羟基在酶的催化作用中起到重要作用，且羟基处在-位时酶的活力比处在-位时高约160倍。底物分子中的任何一点改变都会显著降低其氧化速率。表7-14 葡萄糖氧化酶的底物特异性2 pH对葡萄糖氧化酶作用的影响o 葡萄糖氧化酶的最适pH值为5.6，在pH3.5pH6.5之间保持良好的稳定性。结晶酶在pH3.57.6，40下稳定。没有保护剂存在的情况下，pH大于8.0或小于2.0酶将迅速失活。o 酶的底物起着稳定酶的作用，例如，在pH8.1和不存在葡萄糖的条件下，10分钟内酶活力损失90%；而在相同pH和存在葡萄糖的条件下，40分钟内酶活力仅损失20%。o 在实际工作中的特定环境下，低pH时也可以使用葡萄糖氧化酶。例如，30时的霉菌葡萄糖氧化酶制剂在pH2.6条件下的可乐饮料和pH3.2的葡萄饮料中的酶制剂仍具有较高的稳定性（见表7-15）。尽管在该环境下葡萄糖氧化酶的反应速度较慢，但它仍能起到催化作用。表7-15 葡萄糖氧化酶的相对稳定性3 温度对葡萄糖氧化酶作用的影响o 葡萄糖氧化酶的作用温度范围较宽，最适作用温度为3050，在低温下有很好的稳定性。固体葡萄糖氧化酶制剂在零度下至少可稳定保存两年，-15下可稳定保存8年，但温度一旦高于40酶活将逐渐丧失。酶的水溶液在60下保持30分钟，活力损失将达80%以上。o 葡萄糖氧化酶催化反应需要氧的参与，反应温度改变将导致反应体系中氧的浓度发生改变，从而影响酶活性。温度升高时，反应体系中氧的溶解度下降，这就抵消了温度升高对酶反应速度的影响。葡萄糖氧化酶催化的反应具有较低的Q10；在一定温度范围内（3060），温度变化对葡萄糖氧化酶活力的影响不显著。必须指出，酶的最适作用温度和测定酶反应速度的时间有关。4 葡萄糖氧化酶的抑制剂o 葡萄糖氧化酶的抑制剂为Hg2+、Ag+、Cu2+ 、对氯代汞基苯甲酸、苯基脲乙酯及NH4OH、肼、苯肼、亚硫酸钠、双甲酮等。腺嘌呤二核苷酸（FAD）对其结构有稳定作用。甘露糖、果糖以及D-阿拉伯糖对葡萄糖氧化酶有比较明显的竞争性抑制作用，因此不宜与其共同使用。氰化物和一氧化碳对酶没有抑制作用。o 另外，一些可溶性的高分子聚合物，尤其是醋酸乙烯酯、吡咯烷酮乙烯或乙烯醇的共聚物，可明显增强酶的稳定性。5 葡萄糖氧化酶的分子组成及其作用机制 o 葡萄糖氧化酶以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基，每克分子酶含2克分子FAD，来源不同，其分子量亦有所差别。o 目前葡萄糖氧化酶的工业酶制剂主要来源于黑曲霉，因此黑曲霉葡萄糖氧化酶是这类酶中研究得最为彻底的一种。黑曲霉葡萄糖氧化酶分子量为160000左右。o 实验数据证明，葡萄糖氧化酶催化的反应的速度同时取决于O2 和葡萄糖的浓度，反应遵循Ping Pong Bi Bi机制，可以用下面的图表来表示：o 图中G和L分别代表-D-葡萄糖和-D-葡萄糖酸内酯。也可以用下式描述葡萄糖氧化酶催化的反应：o 反应中，氧化态酶EFAD作为脱氢酶从-D-葡萄糖分子中取走两个氢原子形成还原态酶EFADH2和-D-葡萄糖酸内酯，随后-D-葡萄糖酸内酯非酶水解成D-葡萄糖酸，同时还原态葡萄糖氧化酶被分子氧再氧化成氧化态葡萄糖氧化酶。如果反应体系中存在过氧化氢酶，那么H2O2被催化分解成H2O和O2。6 葡萄糖氧化酶在食品加工中的应用o 葡萄糖氧化酶的作用归纳起来不外乎四个方面：一是去葡萄糖，二是脱氧，三是杀菌，四是测定葡萄糖含量。6.1 蛋类食品的脱糖保鲜o 葡萄糖氧化酶最重要的应用之一就是防止美拉德反应。由于蛋清中含有0.5%0.6%的葡萄糖，因此在蛋类制品加工和贮藏过程中，极易发生葡萄糖分子中的羰基与蛋白质分子的氨基结合生成黑蛋白的美拉德反应。美拉德反应不但导致食品中葡萄糖和游离氨基消失，还会使食品褐变、营养损失，风味也会发生变化，甚至产生有毒物质。因此，在蛋制品加工过程中往往要先进行蛋清的脱糖处理，以防止食品因氧化而引起的品质下降和变质。o 早期在蛋制品工艺中多是采用干或湿酵母发酵的方法除去葡萄糖，该方法的缺点是周期长，卫生条件差，产品质量也不理想。近几年来，在干制蛋品加工中已普遍采用葡萄糖氧化酶进行脱糖处理。o 用葡萄糖氧化酶过氧化氢酶体系将还原糖分子上的醛基转变成羧基，这样就消除了美拉德反应中的产物之一-还原糖。反应中需要不断地供给氧气，因此使用葡萄糖氧化酶脱糖时应分次加入适量的H2O2溶液，这样同葡萄糖氧化酶一起使用的过氧化氢酶就能分解H2O2，以补充反应所需要的氧。o 另外，适当降低反应温度可以保持乳状液的稳定性，且由于温度降低后氧在蛋品中的溶解度提高，酶反应速度不受影响。因此，目前食品工业优先选择在低温下完成蛋品的脱糖操作。o 采用葡萄糖氧化酶脱糖后的蛋制品基本上不会发生褐变。另外，脱糖处理后蛋清可保持原有色泽，且蛋腥味消失，起泡性和起泡稳定性均有明显提高，凝胶强度也有所增加。优良的起泡性和高凝胶性是蛋清的重要功能性质，在食品工业上有广泛应用，因此葡萄糖氧化酶脱糖法还有助于提高产品的实用价值。因此相对于其他脱糖方法而言，这也是葡萄糖氧化酶法脱糖的优点之一。6.2 防止食品氧化o 食品在运输贮藏保存过程中，由于氧的作用，容易发生一系列不利于产品质量的化学反应，引起色、香、味的改变。例如，氧的存在容易引起花生、奶粉、饼干、油炸食品等富含油脂的食品发生氧化作用，引起油脂酸败，产生不良风味而造成食品营养损失、变质。氧化也会引起去皮果蔬、果酱以及肉类发生褐变。另外氧的存在也为许多微生物生长创造了条件，导致食品风味品质下降。o 解决氧化问题的根本办法是脱氧。葡萄糖氧化酶是一种理想的除氧保鲜剂，可有效防止食品因氧化而引起的质量下降和变质。罐藏食品可以使用含葡萄糖氧化酶的吸氧保鲜袋防止氧化，罐装果汁、酒和水果罐头等可以直接加入葡萄糖氧化酶以保持品质，另外葡萄糖氧化酶也可以有效地防止罐装容器的氧化作用。 o 脱氧方法具体应用如下：n （1）干鲜食品脱氧瓶装或罐装的干鲜食品贮藏时，因容器密封性差，所以有必要除去氧。可以在容器中防入含葡萄糖氧化酶及其作用底物葡萄糖的吸氧保鲜袋，这样容器中的氧气透过薄膜进入袋中就在葡萄糖氧化酶作用下与葡萄糖反应，从而达到脱氧的目的。n （2）酒类脱氧 啤酒中含氧过高易引起啤酒的氧化，产生老化味，严重影响啤酒质量。利用葡萄糖氧化酶复合体系，可以有效地去除啤酒中的溶氧，在啤酒加工过程中以及包装后的贮藏中起到保护作用。葡萄糖氧化酶用于啤酒脱氧时的使用量为每升啤酒中加10 70 个单位，添加时机以发酵后啤酒与酵母刚刚分离时较为理想。但是，尽管利用葡萄糖氧化酶可以有效地去除溶氧，啤酒风味的稳定性并没有得到很好的改善，因此近几年来葡萄糖氧化酶在啤酒脱氧方面应用的研究进展不大。 n 氧的存在给白葡萄酒的生产造成极大的困难，葡萄皮、葡萄梗和葡萄籽中含有较高的多酚氧化酶和酚类物质，会使白葡萄酒发生褐变，尤其是使用原料的成熟度较差或以霉变的葡萄为原料酿制白葡萄酒，问题更为严重。如在生产过程中添加浓度为2040单位/L酒的葡萄糖氧化酶，便可以有效地减轻氧造成的危害。n 另外，当葡萄糖氧化酶应用于葡萄酒脱氧时，添加适量的葡萄糖可在一定程度上加快氧气消除的速度。白葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶能够防止葡萄酒发生酶褐变和口感、味觉的变化，还可以防止色素的沉淀，延长保存期。n （3）饮料脱氧保鲜 果汁在深加工过程中若发生氧化作用，其中的一些不饱和成分如不饱合脂肪酸和烯二醇类物质将会分解，使果汁品质低下。尤其是Vc 等维生素类的物质的氧化会使营养大量流失。添加葡萄糖1g/L ，葡萄糖氧化酶20mg/L 即可有效防止氧化的发生。 n 含有果汁或天然油的所有柑橘类软饮料风味物质都容易逸失，光照后还会产生日光臭，降低饮料的品质和货架期。采用葡萄糖氧化酶除氧剂可以保持柑橘饮料的新鲜色泽风味。该方法对于无果汁饮料也同样有效，实验证明葡萄糖氧化酶在软饮料中起到保持正常口味、防止饮料氧化褪色、除残氧后降低饮料中氧化的铁质等作用。 n （4）虾肉食品保鲜 由于虾类固有的生物和生物化学特性（含水77% ，蛋白质20.6% ），使得其在加工储藏、运输、及销售过程中很容易腐败变质，严重影响它的经济价值和营养价值。传统的新鲜虾类保鲜方法是采用低温保存，但由于虾类自身存在的多酚氧化酶在虾类冷冻、冰藏和解冻期间仍然保持着活性，致使虾类食品都难以避免地发生褐变，因此对虾类保鲜来说防褐变是非常重要的。 n 如果将虾肉置于葡萄糖氧化酶过氧化氢酶溶液中浸泡，或将酶液加入到包装的盐水中，就能有效阻滞虾肉颜色的改变和防止蛤败的产生。采用葡萄糖氧化酶保鲜的虾肉食品，冷藏、冻藏都能保持二级鲜度，色泽、气味和弹性保持良好。葡萄糖氧化酶在虾、蟹肉等食品保鲜方面的应用有很好的发展前途。n （5）稳定食品乳状液的质量 油水乳化后的食品乳状液如蛋黄酱，由于在加工过程中引入了约占总体积10 20% 的空气，尽管在控制金属离子污染上作了很大的努力，并且使用了螯合剂，然而货架寿命仍然因为受包藏的氧的作用而显著缩短。保藏期间的质量下降主要表现为颜色减褪和蛤败，并失去乳化性。 n 在包装蛋黄酱的密闭容器中适量添加葡萄糖氧化酶过氧化氢酶体系以防止其在贮藏期间的变质，在之后6个月的保藏期内，通过感官评定和测定过氧化值来比较经处理的蛋黄酱和对照试样的质量稳定性（见表7-17），可以得出以下的结论：酶处理的效果显著，而且酶催化反应中生成的葡萄糖酸对于蛋黄酱的风味没有不良的影响。 表7-17 葡萄糖氧化酶过氧化氢酶处理对蛋黄酱稳定性的影响n （6）防止马口铁罐壁氧化腐蚀 罐头生产虽然采用抽真空封罐，但罐头顶隙仍有氧气残留，特别是酸性介质，腐蚀罐壁，形成氧化圈，影响罐内食品的风味，尤其对电素马口铁这样镀锡薄的水果罐头，情况更为严重。在罐头中应用葡萄糖氧化酶，可以减轻和防止氧化圈和罐内的溶锡。在罐装啤酒的情况下，也能减少马口铁罐壁的氧化腐蚀和铁锡等重金属离子的溶出，保持其原有风味。 6.3 杀菌o 由于葡萄糖氧化酶能去除氧，所以能防止好气菌的生长繁殖；同时由于产生过氧化氢，也可起到杀菌的作用。因此葡萄糖氧化酶可用于在特殊情况下防止微生物的繁殖。6.4 葡萄糖氧化酶在食品分析中的作用o 因葡萄糖氧化酶能专一氧化葡萄糖，故可用于定量测定各种食品中的葡萄糖含量。目前利用固定化技术制成的葡萄糖氧化酶分析仪器已广泛应用于发酵行业发酵液中残糖（主要是葡萄糖）的测定，方法简单、快速、准确。用葡萄糖氧化酶测定葡萄糖浓度的方法很多，如量压法、氧电极测定法、比色法、荧光光度法、电化学指示剂反应测定葡萄糖氧化酶反应过程的过氧化物法等。o 另外，葡萄糖氧化酶也可用于测定食品中的果糖含量。需要指出的是，当用酶法测定样品的果糖含量时，如果样品中含有大量葡萄糖（葡萄糖含量/果糖含量5），必须采用葡萄糖氧化酶先将样品中的葡萄糖除去，否则测定的准确性就会降低。o 葡萄糖氧化酶在食品加工中应用还包括：改变转化糖中葡萄糖和果糖的比例；降低玉米糖浆中葡萄糖的含量；加入到面粉中起催熟作用；加入到牛乳中起凝结作用；稳定柑桔饮料及浓缩汁的质量；保护肉制品及干酪的颜色等。然而，应该指出，尽管在这一节中提到了许多关于葡萄糖氧化酶在食品加工中应用的项目，但是其中多数还处于实验室研究阶段，葡萄糖氧化酶在食品工业中的大量应用还有待于进一步的研究和开发。五 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD, EC1.15.1.1）是一类含金属的酶。o 超氧化物歧化酶每克分子酶的氨基酸残基数在300个左右，它在生物界分布极广，广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。目前已知的SOD主要分为三类，即Cu-Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。Cu-Zn-SOD主要存在于包括人类在内的所有高等真核生物中，在真核细胞的细胞浆中分子量约为32000左右，呈兰绿色。 o Mn-SOD在高等生物的线粒体及细菌中均有发现，来自原核细胞的分子量约为48000，来自真核细胞线粒体的分子量约为30000，呈粉红色。Fe-SOD只存在于原核细胞，分子量约在38000左右，呈黄色。三类SOD可能具有不同的进化祖先。o SOD存在于几乎所有靠有氧呼吸的生物体内，从细菌、真菌、高等植物、高等动物直至人体均有存在。含SOD较高的天然植物有大蒜，其他如韭菜、大葱、油菜、柠檬和番茄等也含有。1催化机制o 超氧化物歧化酶的作用机制：催化超氧阴离子的歧化反应。O2¯+ O2¯+2HO2+H2 O2o 根据衰老的自由基学说，老化是自由基产生和清除发生障碍的结果。在生物体内由于作用外界和内在的因素，瞬间能产生大量的自由基。在正常情况下，产生和清除处于平衡状态。但随着机体的衰老，清除内能逐渐减弱，这种平衡被打乱，多余的自由基就能通过多种渠道损害机体。皱纹和老年斑是如何产生的？o 超氧化物歧化酶是专一清除氧自由基的清除剂。SOD能清除O2¯，同时生成H2O2，H2O2可被过氧化氢酶清除生成H2O 和O2。所以，SOD可清除机体代谢过程中所产生的过量O2¯，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象。2理化性质o 当SOD受到外界各种因素，如温度、pH、氰化物、变性剂和电离辐射等的影响，其分子结构和酶活性都会发生变化。2.1热稳定性：o 超氧化物歧化酶是一种金属蛋白，它对热表现出异常的稳定性。实验证明，超氧化物歧化酶在55/1530分钟，60/1025分钟或65/1015分钟的条件下，酶活性的变化不大。加热至75时，其酶活性几乎不会丧失。在离子强度非常低时，即使加热至95其酶活性丧失亦很小。o 牛红细胞中Cu-Zn-SOD的Tm为83，这是至今为止发现热稳定性最高的球蛋白之一。室温下保藏9个月，酶活存留率为60%；保藏一年为51.2%。SOD的热稳定性有种族差异，如大鼠肝中的Mn-SOD不耐热，但从人肝和鸡肝得到的Mn-SOD却很耐热，即使在6570加热数分钟，它的活性也丧失很少。2.2 pH的影响：o pH的改变会引起酶蛋白与金属辅因子结合状态的改变。实验表明，天然的Cu-Zn-SOD在pH3.6时，95%的Zn会脱落，在pH<6.0时，Cu的结合位点要移动，当pH>12.2时酶的构象会发生变化，但总的来说，SOD对pH并不敏感，通常在pH5.39.5范围内对酶活性影响不大。2.3对氰化物的敏感性：o 实验表明，不同种类的SOD对氰化物的敏感性是不同的。所有的Cu-Zn-SOD都对氰化物敏感，相反Mn-SOD却抗氰化物。SOD的这个特性已用于临床诊断。在大多数情况下，正常细胞和肿瘤细胞之间在Mn-SOD活性变化上有差异，肿瘤细胞内的SOD要比正常的低得多。因此能否把Mn-SOD的含量变化做为一个指标