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第三章 蛋白质化学 生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。 恩格斯反杜林论1878学习要求：1. 了解蛋白质生物功能、分类。2. 了解氨基酸分类、结构，掌握其重要化学反 应和分离、分析方法，重点弄清楚它的两性 性质,pI和 Pk。3. 掌握蛋白质的一级结构及其序列分析方法。 掌握蛋白质二、三和四级结构的基本概念。4. 了解蛋白质的重要理化性质。5. 了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。一、蛋白质概述1、概念蛋白质（protein): 是由20种L-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。2、 蛋白质的化学组成元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量蛋白质的含氮量v 大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：v 样品中蛋白质含量=蛋白氮×6.25v 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）分子组成： 经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸： 3、蛋白质的大小与分子量n 蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。n 蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。n 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV：4x107）1 D = 1.66033 ´10-27 Kgn 对于只含有多肽链的简单蛋白质：n 氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110 （氨基酸残基平均分子量 110）4、蛋白质的分类分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能 按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白； 按分子组成：简单蛋白和结合蛋白； 按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇 溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等。 按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白5、蛋白质的生物学功能催化作用：几乎所有的酶都是蛋白质。生物体的结构成分。运输和储存。运动作用： 动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动。免疫保护作用。激素作用：胰岛素等。接受和传递信息的受体：受体蛋白，控制细胞生长、分化：生长因子、阻遏蛋白。毒蛋白：植物、微生物、昆虫所分泌。许多蛋白在凝血作用、通透作用、营养作用、记忆活动等方面起重要作用。6、蛋白质的水解Ø 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.Ø 完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。Ø 所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。Ø 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。二、蛋白质的基本结构单位氨基酸 （amino acid）n 氨基酸的结构n 氨基酸的种类及结构n 氨基酸的重要理化性质n 氨基酸（amino acid, 简写aa)： 蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。n 天然蛋白质由20种氨基酸组成。1、氨基酸的结构a、通式：-氨基酸中碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸） 由通式可得出： 1）组成蛋白质的aa都是-氨基酸 （除脯氨酸 亚氨基酸外） ；（2）不同aa仅R链不同；（3）除甘氨酸外，其余aa的-碳原子均为不对称碳原子。2、-氨基酸的构型：构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型。立体构型：氨基在左为L-型；氨基在右为D-型。天然蛋白质中的aa均为L-型；两型aa的生理功能不同。3、 - 氨基酸具旋光性左旋（-）：能使偏振光向左；右旋（+）：能使偏振光向右。旋光特性表示： 比旋光度D ， L-氨基酸比旋光度见P76表3-7构型与比旋光度无直接对应关系n 氨基酸的旋光性和旋光角度与R基团的性质及测定时溶液的pH有关；n 当某氨基酸以等量L、D型混合时，旋光抵消，称外消旋；n 化学合成所得氨基酸为D、L各半的混合物，称DL型，无旋光性，可用化学或生化方法将二型分开，此时才表现出旋光性。（二）氨基酸的种类及结构1、根据是否组成蛋白质来分 非极性R基团氨基酸 （8种）：丙氨酸（Ala） 缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu） 异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro） 苯丙氨酸（Phe色氨酸（Trp） 甲硫氨酸（Met）特点：不易溶于水R基疏水性大小: Ala Met Pro Val Leu Ile Phe Trp这类氨基酸R基的疏水性，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。Pro是唯一的一种-亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段-螺旋之间的拐角处. 极性不带电荷R基团氨基酸（7种）：甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr） 天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln）特点：侧链含极性基团，在生理条件下不解离，易溶于水，R侧链能与水形成氢键。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。Cys中R含巯基（-SH），两个Cys的巯基氧化生成二硫键，二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义 CysssCys R基团带负电荷氨基酸：天冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu）在生理条件下,侧链羧基完全解离，带负电荷。为酸性氨基酸 R基团带正电荷氨基酸：赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）氨酸（His）为碱性氨基酸，在生理条件下，侧链解离，带正电荷。4、按人体是否可合成来分：必需氨基酸：Lys Val Ile Leu phe Met Trp Thr 半必需氨基酸：Arg His非必需氨基酸：其余氨基酸5、蛋白质中几种重要的稀有氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。6、非蛋白氨基酸广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在蛋白质中的一类氨基酸，大部也是蛋白质氨基酸的衍生物。结 构 特 点：（1）大多是L-型氨基酸的衍生物，L-瓜氨酸（Cit） 、L-鸟氨酸（Orn）（2）-、-、-氨基酸 -Ala、-氨基丁酸。（3）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中） D-Phe（短杆菌肽S非蛋白氨基酸存在的意义：1.作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分：D-Glu D-Ala2.作为一些重要代谢物的前体或中间体: b -丙氨酸（VB3）、鸟氨酸（Orn）、胍氨酸（Cit）(尿素)3.作为神经传导的化学物质：-氨基丁酸4.有些氨基酸只作为一种N素的转运和贮藏载体（刀豆氨酸）5.杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-羟色氨酸能防止毛虫的危害，高精氨酸能抑制细菌的生长。（三）氨基酸的理化性质1. 氨基酸的一般物理性质 氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。 旋光性：旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的，称右旋光物质，记为“+”，使偏振面向左旋的，称左旋光物质，记为“-”。氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。除甘氨酸外，其它氨基酸的-C原子都与四个不同的原子和基团连接，因而是不对称C原子。手性中心（chiral center）：当一个C原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。 氨基酸的光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力,因其含有苯环共轭双键的R侧链。 酪氨酸的lmax275nm，苯丙氨酸的lmax257nm，色氨酸的max280nm。 所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。此法快速简便。 高熔点 一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。 氨基酸一般有味2、两性解离与等电点（两性性质）：（1）氨基酸为两性电解质：氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主要时以两性离子的形式存在。氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。（2）氨基酸解离方式取决于所处环境的pH：在电场中，阳离子向负极移动；阴离子向阳极移动；调整pH，使氨基酸净电荷为零时，氨基酸既不向阳极也不向阴极移动。（3）等电点（isoelectric point, 缩写为pI）：特点：净电荷数等于零，在电场中不移动；此时氨基酸的溶解度最小。 等电点相当于该氨基酸（aa）两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。 A、对侧链R基不解离的中性氨基酸： pI=1/2（ pK1+ pK2）即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。氨基酸的解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。当1mol的甘氨酸溶于1L水时，溶液的pH约为6，此时甘氨酸为兼性离子状态R+。若用标准NaOH滴定，以加入的NaOH摩尔数对pH作图，得滴定曲线B,在pH9.60处有一拐点（滴定中点)。R+作为酸，由NH3+提供质子，逐渐变为R-,滴定中点时有一半R+变为R-,即 R+=R-，则 K2 = H+pK2=pH(拐点处）pK2就是R+的NH3+50%解离时溶液的pH值，K2就是此时溶液的H+若用HCl滴定，在pH2.34 处有一拐点，拐点处pH即为pK1。R基不解离的氨基酸都有类似甘氨酸的滴定曲线。氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是当加入酸或碱时具有抗pH改变的溶液，缓冲剂起作用的pH范围称为缓冲范围，通常定义为pK+1至pK-1。20种基本氨基酸中只有组氨酸的咪唑基的pK最接近生理pH值（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。（血红蛋白）中性AA的等电点计算： 酸性AA的等电点计算：碱性AA的等电点计算：氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值之和的二分之一。1.当外液pH为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。2.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。3.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电场中向阴极移动。4.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。3、氨基酸的重要化学性质亚硝酸盐反应烃基化反应酰化反应脱氨基反应西佛碱反应 侧链反应（-SH-OH等）-氨基参加的反应1.与丹磺酰氯反应(与酰化试剂反应）弱碱酸DNS + AA /多肽/蛋白DNS-AA /多肽/蛋白DNS-AA +游离AA（乙醚抽提，有荧光，纸电游，薄层层析鉴定）用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.2、氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应，烃基化反应）+ 弱碱+ HF DNFB氨基酸sanger反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸。DNFB+多肽/蛋白/AADNP-多肽/蛋白/AA + HFDNP-AA 弱碱 酸解（有机相） + 游离AA（水相）3、氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应（Edman反应）+ 弱碱 PITCEdman反应鉴定多肽或蛋白质 NH2末端氨基酸。PITC+ 多肽/蛋白PTC多肽/蛋白PTH-AA + 少一个弱碱无水甲酸或HFAA的多肽或蛋白应用：多肽顺序自动分析仪羧基参加的反应叠氮反应: 酰化氨基酸甲酯 酰化氨基酸酰肼酰化氨基酸叠氮用途：活化羧基，用于肽的人工合成。-氨基和-羧基共同参加的反应:1. 与茚三酮的反应： -氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨和还原型茚三酮）生成兰紫色化合物（Pro和Hyp呈黄色,440 nm），色深与溶液中氨基浓度成正比。应用：可定性或定量测定各种氨基酸。 a、根据颜色深浅，在570（440）nm处 测OD值，可知样品中氨基酸含量。 b、定量释放的CO2可用测压法测量，计算出参加反应的aa量。 c、蛋白质和多肽亦可反应，但灵敏度差。2. 成肽反应：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以合成肽，形成的键称肽键。侧链基团的化学性质 对羟汞苯甲酸，作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒(1) 巯基（-SH）的性质 胱氨酸，作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或打开。（2）羟基的性质（3）咪唑基的性质组氨酸含有咪唑基，它的pK2值为6.0，在生理条件下具有缓冲作用。组氨酸中的咪唑基能够发生多种化学反应。可以与ATP发生磷酰化反应，形成磷酸组氨酸，从而使酶活化。组氨酸的咪唑基也能发生烷基化反应。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或丧失。作用：判断酶的活性中心。4、氨基酸分离和分析分配层析法和离子交换层析a.分配层析法：一种溶质在两种互不相溶或几乎不相溶的溶剂中分配时,在一定温度和压力下平衡后,溶质在两相溶剂中的浓度比值,此比值称分配系数(Kd=CA/CB,各种aa都有特定的分配系数，分配系数差异越大，愈容易分离）.固定相：借助一定支持物（如：纤维素、淀粉、硅胶等亲水性不溶物质），以结合水为固定相。流动相：以与水不溶的有机溶剂（如：酚、正丁醇）为流动相。方法：流动相流过支持物，将分配系数不同的氨基酸分开，以茚三酮显色，形成色谱，扫描定量，或洗脱后比色定量。 纸层析：将氨基酸混合物点在滤纸的一角，然后在一个密闭的容器中用一个溶剂系统沿滤纸的方向进行展层，烘干滤纸后，旋转90 。，再在另一个溶剂系统中进行第二向展层。由于氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的分配系数，因此就彼此分开，分布在滤纸的不同区域。利用茚三酮显色，就得到了滤纸层析谱。b.离子交换层析，原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。 阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H强酸型），羧基-COOH（弱酸型） 。阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH- 。高效液相色谱法，HPLC的特点: 固相支持物颗粒小，比表面积大；溶剂系统采用高压，流速快；适于各种类型的支持物的柱层析；HPLC分离氨基酸的灵敏度高，可达到10-12mol水平 。电泳分离：带电颗粒在电场中移动。氨基酸是两性离子化合物，在不同的pH条件下，携带不同的电荷。当把氨基酸混合液点在用一定缓冲液浸湿的滤纸条上的时候，混合液中的各组分能根据它们所带电荷的种类和静电荷的多寡，在电场中以不同的速度向不同方向泳动，从而把它们分开。氨基酸的制备和应用状况：（二）氨基酸的用途蛋白质的基本组成；对生物体具有其他特殊的生理作用，参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病；用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂;用于饲料添加剂；调节皮肤pH值和保护皮肤的功能。三、 肽（peptide）1、 肽与肽键一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽键（peptide bond）：肽平面，构成肽键的四个原子（C、O、N、H）和与之相连的两个碳原子都处在同一个平面内，此刚性结构的平面称肽平面或酰氨平面。肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，C=O与N-H或两个-碳原子以反式结构存在。2、肽链中AA的排列顺序和命名在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,简写：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA残基放在右边。共价主链：肽链的骨干是由-N -C -C -序列重复排列而成，称为共价主链。3、肽的重要理化性质（1）.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高,以偶极离子形式形成离子晶格。（2）.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。（3）.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。4. 肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、 Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应。双缩脲反应:双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应。 Cu2+(碱性溶液)5、 天然存在的重要多肽 红紫色络合物在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。 短杆菌肽S(环十肽)：由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症。 谷胱甘肽：存在与动、植物及微生物中。1.参与体内氧化还原反应。2.作为辅酶参与氧化还原反应保护巯基酶或含Cys的蛋白质中SH的还原性,防止氧化物积累。四、蛋白质的分子结构 蛋白质的结构：蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。1. 蛋白质的一级结构1) 定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。牛胰核糖核酸酶（RNase）：一条多肽链，124AA残基组成，四 个链内二硫键，分子量12600.它是测出一级结构的第一个酶分子。胰岛素（insulin ）的一级结构：胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键。 2) 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给出更多的信息。为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是分子病理学的一个重要部分。蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。核苷酸序列分析的不足(1) 测定蛋白质一级结构的要求a、样品必需纯（>97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA数目，工作量大小。c、知道蛋白质由几个亚基组成；(2). 测定步骤A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。B.多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式：a.与肽链竞争氢键b.增加非极性侧链在水中的溶解度。C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇【SH-CH2-CH2-OH】 (还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。D.分析多肽链的N-末端和C-末端。多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。C-端氨基酸分析：1、肼解法此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。2、羧肽酶(carboxypeptidase)法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽链断裂法：酶解法和化学法。酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等胰蛋白酶：Trypsin ：R1=Lys和Arg时（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。糜蛋白酶：或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。胃蛋白酶：Pepsin：R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro 水解受抑。嗜热菌蛋白酶：thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。G.确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 H.确定原多肽链中二硫键的位置。采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定。一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。 测定步骤：1.测定蛋白质分子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子中的多肽链3.断裂多肽链内的二硫键4.测定多肽链的氨基酸组成5.分析多肽链的N末端和C末端6.多肽链部分裂解成肽段7.测定各个肽段的氨基酸顺序8.确定肽段在多肽链中的顺序9.确定多肽链中二硫键的位置蛋白质的分类(回顾)：分类原则：按分子形状、分子组成、溶解度、生物功能 按分子形状：球状蛋白和纤维状蛋白； 按分子组成：简单蛋白和结合蛋白； 按溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等; 按生物功能：酶、运输蛋白、营养和储存蛋白、运动蛋白、结构蛋白和防御蛋白。纤维状蛋白分子：角蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白、肌纤维蛋白。功能:在生物体内保护、支持、结缔功能。球蛋白分子：血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗体等2. 蛋白质的二级结构与纤维状蛋白1) 构型与构象 (1)构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。(2)构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。 2）蛋白质的构象概念：蛋白质的构象即蛋白质空间结构（高级结构），指蛋白质分子中所有原子和基团在三维空间的排列及肽链的走向。一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。这一事实说明了天然蛋白质共价主链上的单键不能自由旋转。 蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现： 1.肽键具有部分双键性质：C-N单键键长0.149nm，C=N双键键长0.127nm肽键键长0.132nm 2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子（C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane).X-射线结晶学分析的三个阶段：分辨率0.6nm 多肽主链的折叠和走向；分辨率0.2nm 可以辨认分子的侧链基团；分辨率0.14nm 识别所有的氨基酸。 3) 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。 主要有a-螺旋、b-折叠、b-转角、自由回转(无规则卷曲、无规则区域)。(1) a-螺旋（a-helix）及结构特点a. 肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;b. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。c. 蛋白质中的a -螺旋几乎都是右手螺旋。关于a-螺旋的几点说明：a-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。a-螺旋中每个残基（Ca）的二面角f和y各自取同一数值，即f=-57°、 y=-48° 。a-螺旋有左手和右手螺旋，蛋白质中的a-螺旋几乎都是右手螺旋。a-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。a-螺旋的形成及其稳定性与其氨基酸组成和顺序有关（Pro、polyLys、PolyHe）。 a-螺旋折叠过程中存在协同性。a-螺旋的书写形式为：3.613-螺旋。(2) b-折叠（b-pleated sheet）b-折叠或b-折叠片也称b-结构或b-构象，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构。b-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。b-折叠的特点：b-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链间氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。b-折叠有两种类型：一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边(如,- 角蛋白)。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反(如,丝心蛋白)。（3）- 转角(- turn)链内形成氢键，多肽链出现180°的回折。此回折角称- 转角结构。此结构广泛存在球状蛋白中。在b-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个比较稳定的环状结构。它是一个非重复性结构。（4）自由回转(random coil)（亦称无规则卷曲、自由绕曲,但决非变性蛋白的无规卷曲）有时在球状蛋白分子表面有时在其分子内部指无规律的松散肽链结构。通常酶蛋白包含此构象，蛋白功能的可塑性较大，灵活易变。4） 超二级结构1.超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（a-螺旋或b-折叠或b-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。2.超二级结构的基本类型：aa、 bab、bbb（1） aa由两股或三股右手螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。（2） bab由两段平行的b折叠股和一段连接链（或是a螺旋、或是无规则卷曲)组成。（3）bbb由若干段反平行的b折叠股组合而成，两个b折叠股间由一个短环连接起来。纤维状蛋白 ： 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于10(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。5) 结构域（domain）结构域：指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上，进一步卷曲、折叠形成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域这一折叠层次的出现不是偶然的：具有结构上的意义;具有功能上的意义.3. 蛋白质的三级结构1) 蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维分子结构。2) 维持三级结构的作用力氢键（主链内部、侧链之间、侧链与主链、侧链与介质水、主链与介质水）；范德华力；疏水相互作用-疏水效应（疏水键）在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象称为疏水相互作用；离子键（盐键）；二硫键；疏水相互作用，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。4. 蛋白质的四级结构亚基：几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，这种肽链称该蛋白质的亚基(subunit)。四级结构：亚基间通过非共价键聚合而成的特定结构。寡聚蛋白质：有两个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白质或多体蛋白质。维持蛋白质四级结构的主要作用力：氢键、离子键、范德华力、疏水相互作用和二硫键。即亚基之间主要通过次级键彼此缔合在一起；疏水相互作用是最主要的作用力。五、蛋白质分子结构与功能的关系(一) 蛋白质一级结构与功能的关系1.同功蛋白质一级结构的种属差异性 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物、微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。cytC三维结构的保守性：与血红素定位有关的6个AA不变： 2Cys His Met TyrTrp裂隙处AA保守拐弯处AA保守共计28AA严格保守。2.蛋白质一级结构的变异与分子病分子病指蛋白质分子中由于AA