肝螺杆菌与幽门螺杆菌的功能基因组比较分析修改.doc

南方医科大学成人高等教育毕业论文题目：肝螺杆菌与幽门螺杆菌的功能基因组比较分析作者姓名：曾秋银专业：高级护理年级：2008级专升本摘要: 肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus，Hh)是迄今为止发现与肝脏疾病相关的5种螺杆菌之一。Hh株ATCC51449的全基因组测序已经完成。分析发现Hh有和幽门螺杆菌(Hp)一样的尿素酶、鞭毛蛋白和粘附素同源基因，而编码趋化蛋白及细胞致死性肿胀毒素(CDT)的特性则与空肠弯曲菌类似。Hh缺乏大多数与Hp同源的定植和毒力因子如cag致病岛。此外Hh还有一个与霍乱弧菌相似的致病岛HHGI1。上述基因特点该菌肠道定植的适应性与致病潜能。关键词: 肝螺杆菌 幽门螺杆菌 基因组 Analysis of functional genome of Helicobacter hepaticus in comparison with that of Helicobacter pylori. NIU Ling-yun，LI Jing BAI Yang，WANG Ji-de*. * Department of Digestive Medicine，Nanfang hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515,ChinaAbstract: Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) is one of the five hepatic pathogenic helicobacters identified up to now. Genomic sequence of H. hepaticus ATCC51449 has beem published. Homologue genes to H. pylori including urease, flagellin protein and adhesions have been found in H. hepaticus. Other functional genes such as chemotactic protein and cytolethal distending toxin (CDT) are similar to that encoded by campylobacter jejuni. H. hepatius does not encode some well known colonization or virulent factors of H. pylori such as cag pathogenicity island. On the contrary, it contains a specific cluster of gene designated as HHGI1 (Helicobacter hepaticus genomic island) that encodes a protein similar to the Hcp (hemolysin-coregulated protein) of Vibrio cholerae. The genomic features of H. hepaticus may reflect the capacity of colonisation and pathogenicity of this bacterium.Key Word: Helicobacter hepaticus, Helicobacter pylori, Genome自1989年提出螺杆菌属以来，已经正式命名了20种，根据它们喜好的定居部位，可被分为胃螺杆菌和肠肝螺杆菌。肝螺杆菌(Helicobacter Hepaticus，Hh)是一种肠肝螺杆菌，定植于下消化道,包括盲肠,结肠以及肝胆管系统，目前为止还没有在胃内找到。该菌的自然宿主是鼠类,但在人类组织也有检出的报道。研究表明该病原可以引起慢性活动性肝炎和盲肠结肠炎1-3，也与结肠癌及肝胆管腺瘤及癌有关4-5，此外肝螺杆菌的感染还可在某些免疫缺陷小鼠中诱导炎症性肠病(IBD)的发生6-7。一株肝螺杆菌(ATCC51449)的基因组序列已经公布，是含有1799146个碱基对的环状染色体，可以编码1875种蛋白质，它缺乏大多数已知的Hp毒力因子同源物，如粘附素，VacA细胞毒素，几乎所有的cag致病岛蛋白，但是含有与空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)同源的粘附素PEB1和细胞致死性肿胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)。此外还包括基因岛HHGI1和其它几个基因小岛，它们的特点是G+C含量与其余的基因有所不同。目前研究表明肝螺杆菌具有很少的特征性标志，只有一些基因有特点，如16sRNA基因可以编码18kDa的致免疫蛋白8，cdtABC可以编码CDT，ureABC的部分序列编码尿素酶结构亚单位9。本文以Hp为比较，就该菌的基因组作一简要分析，以利于明确该菌潜在的致病产物与机制。1.肝螺杆菌基因的一般特性肝螺杆菌ATCC51449含有1799146个碱基对，稍多于Hp(1.64Mbp和1.67Mbp)和Cj(1.64Mbp) 10-12。其G+C含量为35.9%，介于Hp(39%)和Cj(30.6%)之间的平均水平。可以编码1875种蛋白质,其中可靠的有功能的蛋白质713种，占38.0%；637种为公认的保守蛋白，占35.9%(其中309种有一些证据支持是有功能的，其余364种是无功能的)；489种没有相应有意义的数据，占26.1%。将肝螺杆菌的开放阅读框(Opening Reading Frame, ORFs)与Hp菌株26695和J99全序列进行比较,可以发现分别有938和941个蛋白质同源(50.2%)；与Cj菌株NCTC11168相比有953个蛋白质同源(50.8%)。与两种细菌都同源的蛋白质有821个，与Hp同源但在Cj中不存在的有109种，与Cj同源而Hp缺乏的有130种。肝螺杆菌所编码的蛋白有一些与Hp更相似，如许多鞭毛和趋化性的蛋白质FlaA，FlaB，FlgK，CheV，FliS。有一些与Cj更加相似，如HH0646编码的铁氧化还原蛋白FrxA，涉及到生物素代谢的几个酶BioA，BioC，BioF。这些蛋白质具有非常高的同源性可能是为了更有利于在肠道和胃环境内生存而对蛋白特性进行高度选择的结果13。2.肝螺杆菌的重要功能基因2.1尿素酶尿素酶是细菌的重要定植因子，可以催化尿素水解为NH3和CO2，铵离子可使pH值升高从而使螺杆菌可以在酸性环境中生存和生长。尿素酶同时也是致病因子，其本身可以直接激活吞噬细胞，分泌致炎性细胞因子，加剧胃炎症反应，虽然NH3可以作为蛋白质合成的氮源，但是铵离子对胃上皮细胞有毒性作用14。和Hp一样，Hh也可以产生大量的尿素酶15。已知维持高活性尿素酶需要大量充足的镍离子(一个Hp尿素酶分子可以结合六个镍离子)。肝螺杆菌有一个尿素酶基因簇(ureABIEFGH)与Hp相似，在肝螺杆菌中，ureB和ureI两个基因间的距离为9bp，而Hp大约是200bp16。肝螺杆菌的ureI缺乏关键的组氨酸残基，后者对于Hp尿素转运的酸活化作用很关键。向相反方向转录的尿素酶基因簇的下游，有一个与大肠杆菌(E.coli)镍离子转运基因nikAB(C+D)E同源的基因簇，该基因簇在Hp和Cj中并不存在。由于肝螺杆菌缺乏Hp的镍离子转运载体NixA，热休克蛋白HspA的碳末端镍离子结合区域，富含组氨酸的蛋白质Hpn，它们均涉及到Hp的镍离子转运，因此目前推测的这个摄取镍离子ABC转运系统对于肝螺杆菌来说可能是一个补充17-18。这个尿素酶系统表明肝螺杆菌和Hp基因组编码不同的亚系统，它们可能是从不同的来源获得，也可能是曾经在一个共同的组先中表达，随后每个菌种在各自定居地的逐渐适应过程中部分发生了消失。相对于镍离子摄取系统的不同，铁离子19、亚铁离子以及其它离子如钠离子、钾离子、铜离子、镁离子、钼离子在肝螺杆菌、Hp和Cj中都非常相似。2.2鞭毛蛋白肝螺杆菌的鞭毛合成系统与Hp相似，基因在28和54启动子控制下编码两种类型的鞭毛蛋白FlaA和FlaB。Marika等研究表明将肝螺杆菌抗原(SHelAg)特异性的CD4+Th1克隆转入感染肝螺杆菌的无特定病原体IL-10基因敲除小鼠中可以诱发结肠炎，他们克隆并制备了重组肝螺杆菌鞭毛蛋白(Flagellar Hook protein，FlgE)和SHelAg特异性的CD4+Th1克隆20。FlgE是一个含718个氨基酸的蛋白质，分子量约为77.1kDa。它可以与这个克隆发生特异性的反应，为了定位被CD4+Th1克隆所识别的多肽，他们将FlgE分为4个交错的片段，分别进行克隆和表达，每个片段长度大约是200个氨基酸。实验可见，片段3和4与CD4+Th1克隆反应强烈，表明抗原肽位于这两个片段重叠的44个氨基酸之中。为了确切定位和鉴别抗原肽，又合成了一个15个氨基酸交错重叠的肽段，其中一个肽段(肝螺杆菌FlgE532-546，VEFGGRASFNSDGSL)可以诱导强烈的IFN-反应，证明这个就是被CD4+Th1克隆所识别的肽段序列。数据研究表明肝螺杆菌(FlgE532-546)和现在的哺乳动物的蛋白质之间无同源性，最接近的序列是Hp中的FlgE有15个氨基酸与其有80%的同源性，两者之间有3个氨基酸不同(VEFGGRLHFNNDGSL) 21-22。 2.3趋化蛋白肝螺杆菌基因组显示有9个类化学感受器蛋白(Hp有4个，Cj有10个)，表明肝螺杆菌比起Hp来说可以识别大量更多的空间定位的化学物质，与其有更多的定居位点是一致的。像其它许多高动力细菌(除外Hp)一样，肝螺杆菌有一对基因cheR/cheB可以编码蛋白转甲基酶和甲基酯酶，与趋化适应有关。只有一种推测的化学感受器(HH1088)有可完全匹配共有序列(GlxGlxXXA-S/T)的甲基化基序，这是一种与Cj相似的甲基受体趋化信号转导蛋白,其它的则有一个或多个Glx-Glx基序来改变氨基酸残基。类似不同的甲基化基序也存在于Cj（存在cheB/cheR）和Hp（缺乏cheB/cheR）中，因此在这三种有机体的趋化适应过程中不同的感受器蛋白和甲基化的作用仍然不清楚23-25。2.4毒素和粘附素肝螺杆菌缺乏大多数与Hp同源的定植和毒力因子，也没有空泡细胞毒素vacA，但像Cj一样，肝螺杆菌有一簇基因 cdtABC编码细胞致死性肿胀毒素(CDT),两者之间有很高的同源性,其中cdtA有30%同一性和40%相似性,cdtB有56%同一性和72%相似性,cdtC有40%同一性和55%相似性。CDT存在于大量的粘膜病原体中，如E.coli、Cj、志贺氏痢疾杆菌,杜克雷嗜血杆菌和放线杆菌属26。它可以引起细胞结构的改变，如进行性细胞膨胀,伴有细胞核的扩大,核碎裂,染色质断裂和聚合丝状肌动蛋白的异常积累。还可以引起G2/M细胞周期停滞，最终导致细胞死亡27。只有当完整的cdtABC基因簇存在时才会发挥细胞致病作用，研究表明cdtB在体外有DNA酶活性，在cdtA和cdtC并没有，而且cdtB是全毒素的活性亚单位。尽管CDT可能只在急性感染中起有限的破坏，但它具有的遗传毒性效应在持续的肝螺杆菌感染中有促进致癌的作用28-29。在肝螺杆菌中还有一种颗粒性细胞毒素(granulating cytotoxin)，这种细胞毒素的活性可以在CCL9.1小鼠肝细胞株中证实，以在中毒细胞的胞质中出现颗粒为特征。此外这种毒素与CDT活性也有所不同30。肝螺杆菌也没有cag病原岛的同源基因，除了鞭毛结构，目前也没有证据表明型分泌系统的存在，由于其缺乏多数与Hp感染的病原性相关的特征基因同源物，似乎可以解释肝螺杆菌为什么不定植在胃内，也强调了Hp在胃环境内适应的复杂性。目前研究表明，三种蛋白质PEB1(也叫CBF1)，CadF和JlpA与Cj上皮细胞的粘附素有关31，而肝螺杆菌有一种蛋白质(HH1481)与PEB1有很高的同源性(72%氨基酸相同)，这在Hp中并不存在。HH1481可能是与肝螺杆菌在肠道定植有关的粘附素。在肝螺杆菌和Hp中都缺乏CadF和JlpA的同源物。虽然目前为止还没有在肝螺杆菌中发现菌毛结构，但在肝螺杆菌中存在一个相当保守的前菌毛素肽酶基因(HH0603)，除了经典的信号肽酶(HH1367)之外，还有型菌毛基因和其它菌毛相关基因(HH1115-1117)，表明肝螺杆菌可能能够组装型菌毛，后者可能在粘附素和/或DNA摄取中起作用。2.5 HHGI1-一个可能的致病岛 肝螺杆菌基因组包含有一个大的区域和很多稍小的区域，它们的特点是G+C含量与其余的基因有所不同，表明它们可能是通过水平基因转移获得。这个大的区域术语名为Helicobacter hepaticus genomic island (HHGI1)，G+C含量为33.2%，包括70个开放读码框架(HH0233-HH0302,分子量为71kb)。HHGI1中包含3个蛋白，与型分泌系统的结构组分有同源性。这个岛还包含与霍乱弧菌hcp同源的基因，可以编码与霍乱弧菌溶血素共同调控的分泌性蛋白32。还包含一个基因簇(HH244-HH251)与霍乱弧菌和鼠疫耶氏菌小染色体未知功能的基因簇有明显同源性。与许多致病岛不同，HHGI1与tRNA基因无关，但它包含D4-like整合酶基因(HH269)33。 小结：通过对肝螺杆菌基因组的分析，可以发现目前尚有许多基因功能还未明确，为了进一步探究肝螺杆菌的致病性，需要我们对其进行更深入细致的研究和分析。而且螺杆菌属与人类多种疾病密切相关，目前为止只有对Hp研究比较透彻，对其它螺杆菌的深入研究将会更有利于疾病的治疗和预防。参考文献1. 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Infect Immun, 2001 Sep;69(9):5914-20.致 谢衷心感谢导师史瑞芬主任三年来在我的学习、科研、工作和生活上给予的支持和帮助。导师在课题的设计、实验和总结上给予的指导，使得本研究顺利完成。导师渊博的知识、治学严谨、为人师表、精益求精的治学态度，忘我的工作精神、宽厚正直的品格是我毕生学习的榜样。衷心感谢南方医科大学各位老师在我临床实习过程中给予的悉心指导和帮助。衷心感谢我的同学、师姐、师兄在我实验过程中提供帮助，使得试验得以顺利完成。感谢学院和医院领导、科教科老师给予工作上的指导和支持。最后特别感谢所有参加本次评阅的专家和教授。