醋酸纤维薄膜电泳原理步骤详细.ppt
http:/www.shsmu.edu.cn/,李莉,醋酸纤维薄膜电泳 Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,一、醋酸纤维素（Cellulose acetate ）,是纤维素醋酸酯(acetate ester of cellulose )，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得，将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜 厚度：0.15mm,上海交通大学医学院,Magnification of Cellulose Acetate filter,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,二、醋酸纤维薄膜的特点 Characteristics of Cellulose Acetate Membrane,1.吸附作用小 2.电渗(electroosmosis)作用小 3. 需加样量少 4. 亲水性较小,上海交通大学医学院,血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点 Molecular weight and isoelectric point of serum proteins,上海交通大学医学院,Amido black 10B,上海交通大学医学院,氨基黑10B染色洗脱法结果,上海交通大学医学院,Ponceau S,上海交通大学医学院,丽春红S染色扫描法结果,上海交通大学医学院,Schematic representation of a protein electrophoresis,上海交通大学医学院,几种疾病的蛋白电泳变化 Abnormal serum protein electrophoresis,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,-桥,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,双白蛋白血症,上海交通大学医学院,讲课内容,上海交通大学医学院,三、影响电泳结果的因素 Factors affecting results,1. 电泳图谱不齐,点样时血清点加不均匀 薄膜局部干燥 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 缓冲液变质 电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行,上海交通大学医学院,2. 电泳图谱分离不清,标本加量过多 电流过低 薄膜结构过分致密，透水性差 薄膜表面干燥,上海交通大学医学院,3. 电泳速度慢,电流过低 供给薄膜的液量不足 电泳时温度过低 缓冲液离子强度过高 薄膜中杂质多,上海交通大学医学院,4. 白蛋白（Albumin)区带中间部分不着色，染色不足,可能为染料使用过久或加血清(Serum)过多,5.球蛋白(-globin)向反方向移动,主要因为电渗（ electro-osmosis）现象,可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。,上海交通大学医学院,讲课内容,http:/www.shsmu.edu.cn/,血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis,上海交通大学医学院,原理 CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。 将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 Ions have different migration rates depending on their total charge, size, and shape, and can therefore be separated.,上海交通大学医学院,EQ V = 6r,上海交通大学医学院,器材和试剂 1.器材 （1）醋酸纤维薄膜（8×2mm） （2）点样器 （3）染色皿，漂洗器，镊子 （4）722型分光光度计 （5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽 2.试剂 （1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06） （2）氨基黑10B染色液 （3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O （4）洗脱液：0.4mol/L NaOH,上海交通大学医学院,操作 1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上 2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润 3.将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液 4.用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器,上海交通大学医学院,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图,上海交通大学医学院,5电泳(Electrophoresis) （1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽面朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳 （2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压1015V/cm膜总宽。电泳4060分钟，泳动距离约达3.54cm时即可断电,上海交通大学医学院,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,上海交通大学医学院,6.染色(Stain) 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液510分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分 7漂洗(Wash) 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干,上海交通大学医学院,上海交通大学医学院,8.定量(Quantify) （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算 吸光度总和（T） =A+1+2+（吸光度）,上海交通大学医学院,血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T×100% 1%=1/T×100% 2%=2/T×100% %=/T×100% %=/T×100%,上海交通大学医学院,思 考 题,问答题 1.CAME的基本原理是什么？ 2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？,
