培训资料--肿瘤组织库的建立与管理.ppt
肿瘤组织库的建立与管理,研究目的,探讨分子生物学研究中肿瘤库的建库条件，标本的采集、保存和质量控制，以及肿瘤库的信息化管理等有关问题，创建肿瘤组织标本库，保护和合理利用肿瘤的标本资源，为临床和科学研究人员，提供合适数量的肿瘤标本促进肿瘤的研究。,目录,建库理论基础 材料与方法 结果 讨论 致谢,理论基础,一、建立组织库的三种模式 1.“银行”模式 2.临床试验模式 3.前瞻性收集模式,理论基础,“银行”模式的组织库：按照一定的标准化运转程序（standard operating processeds, SOPs）规范人体组织的收集、加工和储存。 组织标本形式：通常为低温冷冻组织或蜡块。 缺点：不能提供新鲜的、未被冰冻的人体组织，亦不能提供某些有特殊加工需求的组织样本。不能满足研究者对组织块的个性化需求。 优点：可向研究者提供大量的组织样本，并且这些组织均有相关的临床信息和流行病学信息。,理论基础,临床试验模式：是”银行“模式的一个亚型，是由一个或多个临床试验收集的标本构成的标本库。 缺点：其内组织标本的应用受限于伦理委员会的要求，无法被广泛的应用与其他临床研究。同样，组织的大小、采集及加工的方法也不能满足所有研究者的需求。,理论基础,前瞻性收集模式：研究者指定需要的组织类型，同时也制定出所需的组织采集、处理及储存方法。 缺点：没有现成的大量的组织标本以及临床资料，因为组织需要前瞻性的去收集。 优点：研究者能获得他们需要的组织样本，能够满足其研究的个性化需求。,理论基础,二、组织收集 尽量缩短和记录手术摘除或从手术室转移到标本库的时间间隔很重要 Spruessel等人报道，组织离体后30分钟内称80%基因变化少于2个折叠1 Maine等人报道，前列腺组织离体1小时内仅有不到1%基因发生了变化2 术后标本在体外保存5分钟和60分钟相比，其mRNA变化不明显3,1.Spruessel A, Steinmann G, Jung M, Lee SA, Carr T, Fentz AJ, Spangenberg J, Zornig C, Juhl HH, David KA. Tissue ischemia time affects gene and protein expression patterns within minutes following surgical tumor excision. Biotechniques. 2004;36(6):10301037. 2. Maine IP, Varambally S, Shen R, Chinnaiyan M, Rubin MA. Changes in differential gene expression because of warm ischemia time of radical prostatectomy specimens. Am J Pathol.2002;161(5):17431748. 3. Huang J, Qi R, Quackenbush J, Dauway E, Lazaridis E, Yeatman T. Effecs of ischemia on gene expression. J Surg Res. 2001;99:222227.,理论基础,三、组织储存 北京大学季加孚等研究发现：手术后1 h内取材的组织经过3年低温保存，90以上的标本仍有清晰的28S和18S RNA条带，提示RNA完整性较好4 DNA分子稳定性较mRNA好，在-80环境中保存5年，DNA完整性良好5,4.季加孚北京大学临床肿瘤学院肿瘤标本库的建设J北京大学学报：医学版，2005，37(3)：329330 5.张佳年， 于颖彦， 计骏.等. 低温冻存时间对肿瘤组织生物大分子的影响J. 诊断学理论与实践 2009，V018，No1,材料与方法,肿瘤组织库库房，放置液氮罐、冰箱、冰柜等冷冻设备，用于存放标本；分子生物室（中心实验室）用于提取血清、血浆、分离淋巴细胞。 库房设备：液氮罐1个（YDS-30，沈阳新光）， -80立式超低温保存箱2台（DW-86L628，青岛海尔），4-20冰柜1台（BCD-130Eb，青岛海尔）；联想电脑、条码扫描器、条码打印机1套（BP-IP300，德国BRADY）等。,库房,生物样本库资源信息管理系统,主要设备,BRADY条码打印机,液氮罐,海尔-80冰箱,患者入院后行生物安全性检查。检测HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情况。HIV感染患者不列为采集对象。HBV及HCV感染者需在标本上明确注明。 尊重患者的知情权和隐私权，在向患者及家属介绍标本采集和使用目的，获得患者自愿签署知情同意书后，方可安排标本采集和数据录入。,组织采集,手术结束后，标本离体30分钟内完成，在临床肿瘤专家的指导下，在不影响病理诊断取材需要的前提下，采集组织样本。 1）标本取材部位：肿瘤组织、癌旁组织（癌组织旁1cm）和正常组织（癌组织旁5cm及以外或最远处）。 2）过程：使用数码相机拍摄标本外观后，将标本切成小块（直径0.5×0.5cm，厚度0.5cm），为减少处理时间，标本不应切得太小，然后放入无菌冻存管内，做好标记，记录标本采集的时间及标本的类型。每例病人样本保存35份冻存管标本。每份组织重量原则不低于2g。 3）标本冻存管标记后直接冻存于液氮中，后转移至-80冰箱中。标本运送过程中，将其置于冰中保存。,术前血：指临床诊断明确，患者未经任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等，已接受上述治疗的患者样本需详细注明。 术后血：指接受手术后2周，患者未接受任何放疗、化疗或免疫治疗等。,1、取血液标本，每例采集10ml（不少于5ml），约10ml全血平均分装于红帽管（不含抗凝剂，1管）和紫帽管（含2%EDTA抗凝剂，2管）中。 2、红帽管用于分离血清，室温放置30分钟后离心；紫帽管用于分离血浆及淋巴细胞。 3、1500r/min离心10分钟，此时悬液分层，上层淡黄色为血清（红帽管）或血浆（紫帽管），底层为红细胞，紫帽管中中层呈灰白色的为外周血淋巴细胞。 4、轻轻吸取淡黄色上层血清（血浆）放入1.5ml离心管中，每管200µl，共12管（血清6管，血浆6管），做好标记。 5、新鲜抗凝血（含2%EDTA抗凝）去血浆后，按照1:1比例加入PBS液混匀。 6、15ml离心管内先加入3ml淋巴细胞分离液，后加入6ml稀释样品，注意加入样品要缓慢进行，不要冲破液面，影响离心效果。20±2下2000r/min离心20分钟。 7、离心后血样分四层，将移液管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一15ml离心管中，注意吸取过程中避免吸入分层液和血浆。 8、按1:5的比例向淋巴细胞中加入PBS液，混匀洗涤，室温1000r/min离心10min。 9、弃去上清液保留底部沉淀，适用1.5mlPBS液吹打洗涤，置入标记好的1.5ml细胞冻存管中，高速离心机500r/min离心5分钟。 10、弃去上清液保留底部沉淀，血清、血浆及淋巴细胞分装完毕后贴好二维标签。,质量控制,样本DNA完整性检测 方法一：提取样本基因组DNA，检测OD260/OD280值。进行0.7%琼脂糖凝胶电泳。通过DNA电泳判断组织标本的基因组是否完整。无基因组DNA或DNA出现明显降解为不可用样本。 方法二：通过PCR选择扩增管家基因，如GAPD、HHPRT、-actin，分析扩增产物的含量。产物含量相对较少或无产物，可判断为不可使用标本。,质量控制,样本RNA完整性检测 方法一：参照Trizol 试剂盒操作指南进行组织总RNA 的提取。应用紫外分光光度计测260 nm、280 nm OD值定量分析RNA（OD 260/OD 280为1.7-2.0）；1%琼脂糖凝胶电泳后观察5 S、18 S和28 S条带情况。28 S和18 S条带亮度的比值约2:1，表明标本中的RNA完整性较好。出现降解者为不可用样本。 方法二：RT-PCR扩增-actin、HHPRT管家基因，分析扩增产物的含量，产物含量相对较少或无产物可判断为不可用样本。 方法三：Northern Blot检测-actin、HHPRT管家基因，无印记者列为不可使用样本。,蛋白质完整性检测 蛋白质完整性通过Western Blot进行检测，检查标本样本中-actin的蛋白表达量变化，通过分析印记条带，判断蛋白量是否有变化，无条带或条带变弱者为发生组织降解样本。,结果,自2010年7月建库以来共收集保存了各类肿瘤（胃癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等）患者的组织标本1333例，胃癌患者424例，直肠癌267例，结肠癌246例，甲状腺肿瘤254例，胃肠道间质瘤45例，其他类型肿瘤97例。 标本总量11919份，其中包括肿瘤组织1170份，肿瘤旁组织900份，正常组织1113份，血清3923份，血浆3931份，淋巴细胞843份，粪便39份。 已向外省提供60份患者血淋巴细胞样本，用于DNA相关研究，效果良好。,随机抽取近1年的组织样本20例，用Trizol试剂提取组织总RNA，测量各标本的OD260/OD280比值均在1.8-2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳后，28 S和18 S条带清晰明亮，5 S条带很弱，且28 S和18 S条带亮度的比值约为2:1，表明标本中的RNA完整性较好。,讨论,我科室有稳定的肿瘤标本来源，以保证库存标本在数量上不断补充。 目前我科室肿瘤标本库标本的收集、保存 及信息的采集，技术路线已经基本成熟和规范，本肿瘤库可为肿瘤的基础和临床研究提供可靠的标本来源。 组织库运行中的细节、大量组织标本的质量控制以及如何合理利用现有的标本资源，是我们需要进一步完善解决的问题。,谢谢！,
