雪莲多糖的提取及分离纯化工艺研究毕业论文.doc

毕业论文（设计） 题目 雪莲多糖的提取及分离纯化工艺研究 2北京工商大学毕业论文（设计） 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导 下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的 地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为 获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究 提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表 示了谢意。 作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日 期： 使用授权说明使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规 定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权 保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校 可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的 前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名： 日 期： 3北京工商大学毕业论文（设计） 诚信声明诚信声明 本人郑重声明：所呈交的毕业设计（论文）是我个人在导师指导下，由我本人独 立完成。有关观点、方法、数据和文献等的引用已在文中指出，并与参考文献相对应。 据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表和 撰写的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。如在文中涉及到抄袭或剽窃行为，本 人愿承担由此而造成的一切后果及责任。 毕业论文（设计）作者签名： 签名日期： 年 月 日 4北京工商大学毕业论文（设计） 摘要 天山雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir.)，又名新疆雪莲，起来源于凤毛菊属的 水母兔子、绵头雪兔子及天山雪莲花等同属多中植物的干燥地上部分或全草，具有抗 风湿、通络活血的功效，用于头部创伤、热性刺痛、妇科病、类风湿关节炎和脑中风。 雪莲花是我国藏族、蒙古族、维吾尔族、纳西族和普米族常用的珍稀民族药，在本 草纲目拾遗和藏本草晶珠本草中都有记载，现在药理和化学研究表明，雪莲花 类药材主要含黄酮、出体、倍半帖内酚、木脂素和多糖等成分，具有抗癌、抗生育、 调节心血管系统、清除自由基和免役促进等作用。雪莲还有抗菌、抗辐射、抗寒、耐 高山缺氧、强心、解痉镇静、平喘等功效，具有巨大的可开发利用价值。 本文完善了雪莲多糖的测定方法，优化了雪莲多糖的提取，对雪莲多糖进行了进 一步的分离纯化及红外光谱和高效液相测谱特性进行了初步研究。本论文主要结论如 下： 1、比较超声法和恒温水浴加热法提取多糖的实验要求、操作时间及实验结果等因 素，确定用超声法提取多糖。 2、利用苯酚硫酸法测雪莲多糖的含量，以葡萄糖为标准物，选择 6%苯酚 1.0 ml、用 5.0 ml 浓硫酸进行显色 30 min，在 490 nm 处进行测量，可以得到较好结果。 3、利用考马斯亮蓝 G-250 法测蛋白的含量。在相同条件下用三氯乙酸法、 Seveage 法、树脂法进行脱蛋白，比较各方法的蛋白损失率和多糖损失率，确定最适脱 蛋白方法。 4、在相同条件下利用双氧水脱色法、活性炭吸附脱色法、树脂法进行脱色，比 较颜色的差异，同时测溶液的蛋白损失率和多糖损失率，确定最适脱蛋白方法。 5、利用多糖在乙醇溶液中的不溶性，用不同浓度的乙醇溶液进行醇析提取多糖， 并确定各浓度的多糖含量及蛋白含量。 6、利用红外光谱和高效液相色谱的特性对雪莲多糖的单糖组成进行分析。 关键词：雪莲；多糖；超声提取；纯化关键词：雪莲；多糖；超声提取；纯化 5北京工商大学毕业论文（设计） Abstract Saussurea involucrata is a well-known Chinese traditional medicine for the treatment of inflammation, arthritis, menstrual problems and regulating menstrual cycles. Modern pharmacological studies have demonstrated that it possesses some activities such as free radical scavenging, anti-fatigue, anti-inflammation, anti-cancer, and immunomodulation. The extracts of S. involucrata are mainly composed of flavonoids, which are the active components, including apigenin, kaempferide, acacetin, luteolin, quercetin, and rutin etc. According to Chinese Pharmacopoeia, rutin and chlorogenic acid are two components in for quality identification of S. involucrata. This paper carried on the related research on the content analysis and ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds (rutin, chlorogenic acid and syringin) in S. involucrata, and the chemicl compounds contents of different parts of S. involucrata were also investigated. A RP-HPLC method was used for the simultaneous detection of rutin, chlorogenic acid and syringin in S. involucrata, the HPLC flow rate, detection wavelength and column temperature chromatographic conditions were optimized for content detection. Ultrasound- assisted extraction method was studied by single factor experiments and response surface experimental design to optimize the extraction process, the establishment of a multi-model parameter extraction model was verified by experiment. In addition, the main chemical components in different parts of S. involucrata were measured, the results showed flowers, stems and leaves have different levels of each component. Key words: Saussurea involucrata; Chlorogenic acid; Syringin; Rutin; Ultrasound 6北京工商大学毕业论文（设计） extraction; Response surface experiment 目录 第一章第一章 文献综述文献综述.1 1.1 概述1 1.2 新疆雪莲化学成分3 1.2.1从新疆雪莲中提取分离的化合物3 1.2.2多糖的研究进展及意义3 1.2.3多糖的生物活性与构效关系5 1.3 雪莲多糖的生物活性5 1.3.1免疫调节作用5 1.3.2抗肿瘤活性6 1.3.3降血糖活性6 1.3.4降血脂活性7 1.3.5抗病毒活性7 1.3.6抗衰老活性7 1.3.7抗菌活性8 1.3.8其它活性8 1.4 雪莲的应用8 1.4.1滋补品8 1.4.2医药制品8 1.4.3其他9 1.5 超声提取植物有效成分9 1.5.1超声波简介9 1.5.2超声波作用机理9 1.6 立题目的及意义10 第第二二章章 雪雪莲莲多多糖糖的的提提取取方方法法确确定定 11 2.1 实验仪器与材料 .11 2.1.1 实验仪器.11 2.1.2 实验材料及试剂.11 2.2提取方法11 2.2.1恒温水浴加热法11 2.2.2 超声波法.11 2.2多糖含量的测定12 2.2.1标准曲线的绘制12 2.2.2样品多糖浓度的测定13 2.3考马斯亮蓝G-250法绘制蛋白制标准曲线.13 2.3.1标准曲线的绘制13 2.3.2样品蛋白质浓度的测定14 2.4实验及结果分析14 7北京工商大学毕业论文（设计） 2.4.1多糖含量的测定数据14 2.4.2蛋白质含量的测定15 2.4.3 小结.15 第第三三章章 雪雪莲莲超超声声提提取取工工艺艺优优化化 16 3.1 实验仪器与材料 .16 3.1.1 实验仪器.16 3.1.2 实验材料及溶剂.16 3.2 样品溶液的制备 .16 3.3 雪莲多糖脱蛋白方法方法的比较 .16 3.3.1 三氯乙酸法除蛋白.17 3.3.2 Seveage法除蛋白18 3.3.3 树脂法除蛋白.19 3.3.4小结20 3.4 雪莲多糖脱色方法方法的比较21 3.4.1 四种树脂脱色方法处理后样品溶液脱色效果及蛋白和多糖的损失率.21 3.4.2 双氧水脱色方法处理后样品溶液脱色效果及蛋白和多糖的损失率.22 3.4.3活性炭脱色方法处理后样品溶液脱色效果及蛋白和多糖的损失率23 3.4.3 小结.23 3.5 雪莲多糖提取工艺优化24 3.5.1D72 树脂量的确定.24 3.6 利用无水乙醇提取多糖25 第四章第四章 雪莲不同部位成分分析雪莲不同部位成分分析.26 4.1 实验仪器与材料 .26 4.1.1 实验仪器.26 4.1.2 实验材料及溶剂.26 4.2 实验方法 .26 4.2.1 原料准备.26 4.2.2 样品制备方法.26 4.2.3反相高效液相色谱条件27 4.3 实验结果及分析 .27 4.3.1雪莲各部位HPLC色谱图27 4.3.2 实验结果.29 4.3.3 结果分析.29 4.4 小结 .30 第五章第五章 总结及展望总结及展望.31 5.1 总结 .31 5.2 展望 .31 8北京工商大学毕业论文（设计） 1北京工商大学毕业论文（设计） 1 第一章 文献综述 1.1 概述概述 新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir .)又称天山雪莲、雪莲花、雪荷花或大苞 雪莲，是维吾尔医药中的常用民族药，维吾尔名塔裕依力斯，属被子植物门、双子叶 植物纲、菊目、菊科、凤毛菊属雪莲亚属的多年生草本植物，是新疆的珍贵草药之一。 株高 1530 cm 左右，茎直立、粗壮，下部有宿存的褐色残片；叶丛生，近革质，呈 长椭圆形，边缘有锯齿；花苞多层，呈蓬座状，近膜质，白色或浅黄绿色；具管状、 紫红色花冠； 头状花序聚生。 雪莲花是我国藏族、蒙古族、维吾尔族、纳西族和普米族常用的珍稀民族药，在 本草纲目拾遗和藏本草晶珠本草中都有记载，起来源于凤毛菊属的水母兔子、 绵头雪兔子及天山雪莲花等同属多中植物的干燥地上部分或全草，具有抗风湿、通络 活血的功效，用于头部创伤、热性刺痛、妇科病、类风湿关节炎和脑中风。现在药理 和化学研究表明，雪莲花类药材主要含黄酮、出体、倍半帖内酚、木脂素和多糖等成 分，具有抗癌、抗生育、调节心血管系统、清除自由基和免役促进等作用。雪莲还有 抗菌、抗辐射、抗寒、耐高山缺氧、强心、解痉镇静、平喘等功效。 新疆雪莲主要分布于新疆境内的天山山脉、阿勒泰山脉和昆仑山脉，生长于山脉 海拔 4000 米左右的悬崖陡壁之上、冰渍岩缝之中。那里气候奇寒、终年积雪不化，这 种独有的生存习性和独特的生长环境使其天然而稀有，并造就了它独特的药理作用和 神奇的药用价值，人们奉雪莲为“百草之王”、 “药中极品”。 纲目拾遗中就有天山雪莲的文字记载:天山雪莲又名“凤毛菊”，性大热，能补 阴益阳，祛一切寒症，雪莲全草人药，具有通经活血，暖宫散寮、散寒除湿、强精助 阳，止血消肿的功效，使用安全无毒、无副作用，雪莲人肝、脾、肾、三经，治疗急 慢性风湿关节炎及关节疼痛，肺寒咳嗽、宫寒腹痛、闭经、胎衣不下、阳痰和麻疹等 症。 雪莲一般生长在海拔 2400 m 以上的高山冰债石、流石滩石隙中，生态环境恶劣， 自然生长期 5 一 8 年，最后一年开花结种且种子萌发率极低。由于近年来野生雪莲乱 采滥挖现象十分严重，加之人工栽培困难，雪莲已被列为国家 3 级濒危物种而受到保 2北京工商大学毕业论文（设计） 2 护。 3北京工商大学毕业论文（设计） 3 1.2 新疆雪莲化学成分新疆雪莲化学成分 1.2.1 从新疆雪莲中提取分离的化合物从新疆雪莲中提取分离的化合物 化学类型化合物名称 黄酮高车前素、金合欢素、檞皮素1、芹菜素-5,6-二甲氧基黄酮、芹菜 素-6 甲氧基黄酮2 黄酮苷芦丁、檞皮素-3-o-L-鼠李糖苷3 糖类多糖（813） 、天山雪莲花多糖（SIP） 、精制雪莲多糖（SPSI）4 生物碱大苞雪莲碱（13-脯胺酸取代的二氢去氢广木香内酯）5、秋水仙碱 2 倍半萜内酯及内酯 苷 大苞雪莲内酯（4,10-环外亚甲基-8-羟基-11-甲基愈创内酯）6、去 氢广木香内酯7、3-OH,11,13-二氢去氢广木香内酯-8-D-葡萄糖 苷8、11,13-二氢去氢广木香内酯、雪莲内酯、大苞雪莲内酯-8- D-葡萄糖4。 苯丙素类紫丁香苷1、绿原酸2 香豆素类蛇床子内酯、佛手内酯、异茴芹内酯、爱得尔庭、叶鞘二醇二乙酸 酯、别异因波拉托内酯 、噢洛内酯 、花椒香豆素9 1.2.2 多糖的研究进展及意义多糖的研究进展及意义 多糖(polysaccharides)又称为多聚糖，即聚合度超过 10 的聚糖，包括植物多糖、动 物多糖以及微生物多糖三大来源，它是由糖碳键连结起来的醛糖或酮糖组成的天然大 分子物质，是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需的多种生理功能有 关1. 糖类作为生命的信息分子己经得到普遍承认。蛋白质和核酸在生命现象中的重要 性为世人所知，以基因重组为代表的生物工程己经并将大大地造福于人类社会2。但是， 糖类研究却远远落后于蛋白质和核酸的飞速发展。之所以如此，有两个重要原因:第一 是理论上的简单化。人们过低地估计了糖类对生命过程的贡献，缺乏研究兴趣。第二 是在研究方法上较困难。从自然界分离的粗多糖是非常复杂的混合物，其中包括各种 4北京工商大学毕业论文（设计） 4 生物大分子的混合，不同多糖(中性多糖、酸性多糖、杂多糖)的混合以及不同分子大小， 不同糖试键构成的不同多糖的混合物，必须采取适合其结构特点的方法进行分离、分 级和纯化。很少有人肯在方法上花很多工夫3。从天然产物提纯得到纯净的糖聚合物是 非常困难的，合成也是如此。除了很少的例外，基本上蛋白质或核酸是由确定位置连 接而成的线形聚合物。与之相比，因为糖包含许多能与单体成键的轻基所以可合成的 聚合物的组合可能远大于蛋白质或核酸的。而且，糖甚至能在其线形聚合物上伸出侧 链，这让推断纯净的天然糖结构非常困难。除此之外，核酸如 mRNA 等作为遗传表达 的蓝图，蛋白质作为基因表达初产品，仅通过复制和翻译过程，产生的都是相同的聚 合物。因此，相对等量的聚合物能被分离。如果产量不足，对于核酸以 PCR 法，对于 蛋白质以微生物法倍增和提纯。然而，因为在糖合成中没有如核酸那样的蓝图，因而 糖仅是包含由环境不同而产生的多种组分，保持相似的结构，很难得到相同结构的糖， 而且也没有发展倍增技术。如果我们将核酸或蛋白质比作保持体形统一的动物，那么 糖就是植物，有不同的枝叶有不同的形状。 自六十年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物功能4-5。大量的 药理实验表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，同时又能促进 干扰素生成，促进白细胞介素生成，诱生肿瘤坏死因子6。到目前为止，己有近 300 种 的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来。中草药是祖国医学的宝贵遗产，各种 多糖资源十分丰富，具有巨大的开发潜力，故从中药中提取的植物多糖类尤为重要7。 己有不少研究结果确证，糖类作为信息分子在受精、发生、发育分化，神经系统和系 统衡态的维持等方面起着重要作用;炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增殖和 转换胞识别和病原体感染等生物学过程都有糖类的介导。在这一系列的生物过程中， 最重要的生物活性因子便是糖链。它在生命活动中的功用并不亚于蛋白质和脂类，这 就预示着重要的天然糖和人工糖的巨大医疗保健价值，以糖为基础的糖药物学的研究 和开发便成为现在世界生物化学与生物医学交叉点的新的边缘学科8。糖药物的研究与 开发必将成为 21 世纪新药开发的一个重要领域。 糖药物的最重要的特点，它们中间的大多数是作用于细胞表面，参与了细胞和细 胞，细胞和活性分子的相互作用2,9。由于多数以糖类为基础的药物的作用位点是在细 胞表面，而不进入细胞内部，因此这类药物对于整个细胞、进而整个机体的干扰要比 进入细胞核、质内小得多。就这点而一言，糖药物是副作用相对较小的药物。因此不 仅可以作为治疗疾病的药物，而且可以作为保健类药物10。 5北京工商大学毕业论文（设计） 5 我国到目前为止，只有云芝多糖、获等多糖、香菇多糖、裂褶多糖等用于临床， 但它们在抗肿瘤抗病毒、抗衰老、降血糖。愈溃疡等疑难病症的治疗方面己显示了诱 人的前景11。展望未来，我国开发糖药物有着得天独厚的条件，蕴藏了丰富的生物资 源，其中仅特有植物有 92 种，已被研究开发的只占其中很少一部分，同时还有深厚 的传统中医药理论和临床实践可供借鉴。相信经过我国科研人员的辛勤工作，一定会 拥有自己独立的知识产权，在世界糖药物研究领域里写下辉煌的篇章12。 1.2.3多糖的生物活性与构效关系多糖的生物活性与构效关系 多糖具有多种生物活性是与它的化学结构密切相关的。活性多糖的化学结构是其 生物活性的基础。就其一级结构而言，多糖中单糖的组成、糖普键的类型以及一些官 能团对其生物活性都有影响。一般而言，多糖主链上 (1-3)糖着键是其活性前提。在高 级结构层次上，多糖立体结构中 -螺旋具有较强生物活性，可拉伸带状有一定生物活 性，而其它两种结构无生物活性。另外，多糖的分子量溶解度、旋光度、粘度等性状 也影响其生理功能。多糖结构的化学修饰有时可提高其生物活性，如梭甲基化、硫酸 酷化、乙酞化等。但至今为止，多糖构效关系的研究还没有更大的突破。 糖的构效关系就是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系，是当前糖 化学和糖生物学共同关注的焦点问题。37多糖中的官能团的种类或有无对其生物活性 有极大的影响，而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多 糖中官能团的改造己成为研究多糖构效关系的有力手段。多糖的高级结构的研究还较 少，但科学家己肯定多糖的高级结构对功能的影响比一级结构重要得多。X 一衍射分 析表明，香菇多糖及长褶多糖均具 -三股绳状螺旋型立体结构，在香菇多糖加入尿素 或二甲亚矾，其活性就丧失，这二者多糖在水溶液的比旋光度不同在尿素或二甲亚枫 中的旋光度，暗示在尿素或二甲亚矾 A 中，多糖立体构型改变了，从而引起活性的丧 失，这充分证实立体构型对多糖活性的显著性影响38-44。 1.3 雪莲多糖的生物活性雪莲多糖的生物活性 1.3.1免疫调节作用免疫调节作用 免疫调节性是植物多糖最主要和最重要的生物活性，由于现代医学，细胞生物学子 6北京工商大学毕业论文（设计） 6 生物学快速发展，人们对免疫系统的认识越来越深入。免疫系统紊乱，不仅会产生多 种疾病，而且与人体衰老及老年人多发病有关。多糖能在多条途径、多个层面对免疫 系统发挥调节作用。大量免疫实验证明多糖不仅能激活 T 细胞、淋巴细胞、巨噬细胞 Mfi, CTL 细胞、LAK 细胞等免疫细胞的活性，还可以激活网状内皮系统吞噬、自然杀 伤细胞(NK)等免疫细胞，清除老化细胞和异物以及病原体，促进 IL-1, IL-2, TNF,INF-Y 的生成，调节机体抗体和补体的形成及活化促进细胞因子生成，对免疫系统发挥多方 面的调节作用2，从而提高机体免疫力达到抑制或消灭肿瘤细胞的效果。如人参多糖、 黄茂多糖能调节免疫功能;有的还能诱导干扰素的产生。从中药三七中分离提取的多糖 可显著地增强网状内皮系统在碳廓清试验中的活性，并增强小鼠，绵羊红细胞抗体的 生成6。张庆等人的研究表明，大枣多糖具有明显的抗补体活性，能显著促进小鼠脾细 胞的增殖作用13，芦荟多糖具有抗紫外线引起的免疫抑制作用14。多糖不但对机体的 免疫系统受到严重损伤的癌症有明显疗效，又能治疗多种免疫缺失疾病，如慢性病毒 性肝炎和某些耐药细菌和病毒引起的慢性疾病。己发现有 100 多种中药所含多糖类化 合物具有免疫促进作用。 1.3.2抗肿瘤活性抗肿瘤活性 抗肿瘤活性是多糖类化合物所显示的重要生物活性，其特点是毒副作小能提高机 体免疫功能并抑制肿瘤生长，与化疗药物适当组合有协同作用并可降低或免除化疗药 物的毒副作用。多糖抗肿瘤方式大致可归纳为两类，以细胞毒为主的直接抗癌方式和 以免疫为主的间接抗癌方式。如小鼠皮下移植恶性肿瘤浸润性肉瘤细胞后，在 20-46 天内全部死亡，而在移植肿瘤细胞的同时，腹腔注射芦荟多糖，则可使动物存活率达 到 40%，香菇多糖提取物不仅能抑制小鼠实体肿瘤的生长，而且能干扰体外培养的人 肝癌细胞的增殖，人参，南瓜多糖也具有抑瘤作用15-16。 1.3.3降血糖活性降血糖活性 有研究表明17植物多糖能够促进胰岛分泌胰岛素，影响糖代谢酶的活性，促使外 周组织对葡萄糖的作用，抑制糖异生。从 M,芭仁中分离提取的慧芭仁多糖，腹腔注射 100 mgkg，能显著降低正常小鼠及糖尿病小鼠的血糖，并呈剂量效应18。玉米多糖 对糖尿病小鼠的降糖作用强于正常小鼠，高剂量组降糖幅度大于低剂量组15。南瓜多 7北京工商大学毕业论文（设计） 7 糖、人参多糖、麻黄多糖、知母多糖、高山红景天多糖等经实验证明均有降低血糖作 用。茶多糖具有明显的降血糖的作用，其中有降血糖作用的多糖为半乳葡聚糖919。 1.3.4降血脂活性降血脂活性 高血脂症是一种常见病多发病，血清胆固醇。甘油三脂含量是此病的重要指标。 血清中 TC 升高是诱发动脉硬化冠心病的重要因素，血清中 HDL-C 与发病率成负相关， 可以抑制细胞对低密度脂蛋白(HDL-C)的摄取，阻碍 TC 在细胞内堆积，把过多的 TC 以酯的形式转运出来，从而阻止动脉硬化的发生，因此，HDL-C/TC 更能准确地反映 血脂水平与动脉粥样硬化。冠心病之间的关系20。 1.3.5抗病毒活性抗病毒活性 近年来研究发现，许多多糖具有明显的抗病毒作用。邵传森等报道了中华弥猴桃 多糖体外抗轮状病毒作用。对人类免疫缺陷病毒 HIV 有抑制作用。1987 年，德国的 Bayer 公司研制的木聚糖硫酸酯对艾滋病有较好的疗效。日本的研究也表明，地衣多糖 经硫酸化修饰对 HIV-1 病毒有明显的抑制作用。中科院上海有机所田庚元等于 1996 年 报道，牛膝多糖硫酸酷有抗乙肝病毒的活性21-23。例如从中药夏枯草中分离出来的硫 酸多糖具有抗 HIV 作用6，科学家还进一步发现硫化多糖能从多个环节和步骤干扰 HIV 宿主细胞的侵袭，并对 HIV 有很高的抑制选择性作用19，此外，有报道显示甘草 多糖对牛爱滋病毒，腺病毒，柯萨病毒均具有明显的抑制作用24，芦荟中的甘露聚糖 通过免疫激活作用促进非包被小核糖核酸病毒衣壳蛋白抗原抗体的产生，这种作用可 能有利于自然感染状态的肠道病毒和脊髓灰质炎病毒疫苗抗体滴度的提高14。人们对 将多糖应用于因病毒感染所致艾滋病等疑难疾病的治疗寄予很大的希望。 1.3.6抗衰老活性抗衰老活性 到目前为止，对衰老发生的机理有众多的学说，如免疫学说，遗传学说交联学说， 自由基学说等。其中免疫学说认为，免疫功能具有增龄性变化，即随年龄增大，机体 免疫功能下降或紊乱，结果胸腺萎缩，T 细胞损耗，从而导致机体衰老，寿命缩短由 于多糖类化合物可以增强机体的免疫功能，在一定程度上延缓衰老，防治老年病。科 8北京工商大学毕业论文（设计） 8 学家们已从某些中药中得到了多种多糖类化合物，不但能促进机体的免疫功能，而且 证实了有些多糖确实有抗老延寿的作用如刺五加多糖可延长果蝇平均寿命 11.7-30%， 从构祀子中提取出来的一种多糖复合物，有显著的抗衰老作用。实验表明，它可延长 家蚕五龄期寿命 14%6。此外，油柑，黄蔑，人参等的多糖都有一定的抗衰老作用。 1.3.7抗菌活性抗菌活性 近年来研究发现，许多多糖具有明显的抗菌作用。白毛藤多糖对链球菌、沙门氏 菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡球菌均有较强的抑菌作用25。槲蕨多糖显示了一 定程度的抗细菌和抗真菌活性26。爬山虎果、茎根中提取并纯化多糖用系列真菌和细 菌做抑菌试验，该多糖对真菌和细菌有一定的抑制作用但对酵母不产生抑制作用且抑 制作用随多糖浓度增大抑制效果有增强的特性27。沙棘多糖对大肠杆菌、四叠菌等有 一定的抑制作用28。 1.3.8 其它活性其它活性 多糖除具有上述主要生物活性外，还具有其它活性，包括抗凝血，抗炎，抗惊厥 镇静，止喘及降血压，保肝作用。从动物肠粘膜中提取的肝素是硫酸化的葡萄糖胺聚 糖物质，在临床上用于预防输血凝血及其它血栓性疾病。从虾蟹壳中提取的壳聚糖也 具有抗血栓、预防心血管病变的功效29-31。冬虫夏草多糖治疗慢性乙型肝炎，可在免 疫调节、保肝和抗病毒。 1.4 雪莲的应用雪莲的应用 1.4.1 滋补品滋补品 雪莲保元胶囊经科学方法精制而成，药理试验及临床实践表明，本品具有健脾 益气、滋阴补肾、活血化瘀、延缓衰老之功效 24。 雪莲虫草酒具有通络生血活血、强筋壮骨、健肺补肾，能提高人体免疫能力 25。 9北京工商大学毕业论文（设计） 9 1.4.2 医药制品医药制品 复方雪莲胶囊主要由雪莲、延胡索 (醋制)、羌活、川乌 (制)、独活、草乌 (制)、 木瓜、香加皮等中药组成，具有温经散寒，祛风逐湿，化瘀消肿，舒经活络及止痛 的功效，主要用于治疗风寒湿邪，痹阻经络所致类风湿性关节炎，风湿性关节炎， 强直性脊柱炎和各种退行性骨关节病的治疗 26。 雪莲注射液的主要成分是雪莲黄酮，具有抗炎、消肿、镇痛、去风湿、通经络、 提高机体免疫力、活血化瘀等作用 27。 1.4.3 其他其他 用雪莲香精香料配制的高级护肤霜具有增强血液循环、延缓皮肤衰老作用。雪 莲高级护肤霜已在法国化妆品博览会上获奖 ,产品远销欧美各国，深受用户欢迎 28。 以雪莲为原料制作的菜肴具有补肾壮阳、益气补血等功效,是难得的滋补佳品。 1.5 超声提取植物有效成分超声提取植物有效成分 1.5.1 超声波简介超声波简介 超声波是指频率为 2O 千赫5O 兆赫的电磁波，它是一种机械波，需要能量 载体(介质)来进行传播。超声波在工业应用方面，可以进行清洗、干燥、杀菌、雾 化及无损检测等，是一种非常成熟且广泛应用的技术 29 。 超声提取技术是近年来应用在中草药有效成分提取分离方面的一种最新的较为 成熟的手段。研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈空化效应、 热效应、搅拌作用等，都可以加速药物有效成分进入溶剂，从而提高提取效率，缩 短提取时间，节约溶剂，并且免去了高温对提取成分的破坏。 1.5.2 超声波作用机理超声波作用机理 关于超声波的作用机理的论述较多，通过总结分析，其作用机理主要有以下三 个方面： 10北京工商大学毕业论文（设计） 10 （1）空化效应 空化效应是超声提取的主要动力。液体中往往存在一些真空或含有少量气体或 蒸汽的小泡，当一定频率的大量超声波作用在液体时，尺寸适宜的小泡能产生共振 现象，它们在声波的稀疏阶段迅速胀大，在声波的压缩阶段又被绝热压缩，直至湮 灭。小泡在湮灭过程中 ,能够产生几千摄氏度的高温和几千个大气压的高压冲击波， 这就是空化现象。这种强烈的冲击作用能使物料破碎，也能造成生物细胞壁及整个 生物体破裂，从而加速细胞内物质的释放、扩散及溶解 30。 （2）机械效应 超声在传播过程中，会引起介质质点交替的压缩与伸张，构成了压力的变化， 这种压力的变化将引起机械效应。提取过程中，这种机械效应包括简单的骚动效应 和溶剂与原料粉末之间的摩擦。超声波进入提取溶剂与原料的混合体系后，会赋予 溶剂分子和物料颗粒加速度，使其运动加速，但是由于分子结构不同，溶剂分子的 运动速度远远大于物料的运动速度，从而使二者产生摩擦作用，继而充分混合，使 溶剂更加容易进入物料颗粒内部，使中药材中的有效成分快速溶解于溶剂之中 30。 （3）热效应 超声过程中产生空化效应，即在液体中产生气泡和气泡在超声作用下的特殊作 用。这些气泡在经历稀疏相和压缩相，气泡生长、收缩、再生长、再收缩，经多次 周期性震荡，最终以高速度崩裂，然后闭合，该过程会产生短暂的局部高温、高压。 在这个过程中释放的热量可以有效促进原料细胞内部有效成分的扩散作用 30。 1.6 立题目的及意义立题目的及意义 目前国内外对雪莲开发、利用主要在以雪莲黄酮为主要成分，已研制开发一系列 重要中成药和保健品。其基础研究主要集中对雪莲黄酮在调节血脂、抗氧化等方面都 有明显疗效，对雪莲多糖仅有少量报道,并且雪莲多糖现有的研究也只停留在对资源的 挖掘和粗提物的生理活性研究方面。雪莲是传统的药用植物，具有很高的利用价值， 但是由于生长环境的特殊性，以及人类掠夺性的采挖，以造成了这一宝贵物种资源 枯竭，本文针对野生雪莲 及组培雪莲 所含的多糖成分进行超声 法提取及优化的研 究，为雪莲有用成分的提取提供了理论依据，为合理利用雪莲资源奠定了基础。 11北京工商大学毕业论文（设计） 11 第二章 雪莲多糖的提取方法确定 2.1 实验仪器与材料实验仪器与材料 2.1.1 实验仪器实验仪器 超声波细胞粉碎机 宁波新芝科器研究所 电子分析天平 上海天平仪器厂 电热恒温水浴锅 上虞市仪器厂 台式离心机 分光光度计 2.1.2 实验材料及试剂实验材料及试剂 组培 2-3 年雪莲，标准葡萄糖， 6%苯酚，浓硫酸， 考马斯亮蓝 G-250，牛血清蛋白， 0.15 moll NaCl 溶液。 2.2 提取方法提取方法 2.2.1 恒温水浴加热法 称取粉碎好的 组培 2-3 年雪莲样品 2 g，加入 200 ml 蒸馏水。在 85的水浴 锅中恒温水浴加热 3 h,水浴完毕后离心 5000 r 10 min取上清液，加水定容至 200 ml，待测。 2.2.2 超声波法 称取粉碎好的 组培 2-3 年雪莲样品 20 g，加入 400 ml 蒸馏水，搅拌均匀后放 于提取容器中，超声 15 min600 w 1.5:0.5(s)，过滤分离出上清液 1 和残渣；将残渣 再次加入 300 ml 蒸馏水，超声 15 min600w 1.5:0.5(s)，过滤分离出上清液 2；将两 次上清液混合，待测。超声提取实验装置见图 3.1。 12北京工商大学毕业论文（设计） 12 图 3.1 超声波强化提取实验装置图 1. Temperature controller 2. Temperature probe 3. Ultrasonic generator 4. Ultrasonic converter 5. Extract 6. Water bath 2.2 多糖含量的测定多糖含量的测定 测定方法主要采用苯酚-硫酸法。 2.2.1 标准曲线的绘制 1、溶液的配制、溶液的配制 （1）6%苯酚溶液的配制：称取苯酚 6 g，置于 100 ml 棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解并 稀释至刻度，摇匀，放入冰箱中备用。 （2）葡萄糖标准溶液的配制：精密称取葡萄糖 25 mg，加蒸馏水溶解，定容至 250 ml，得到浓度为 1.0 mgml 的葡萄糖标准溶液。 2、操作方法、操作方法 （1）称取标准葡萄糖 20 mg 于 500 ml 容量瓶中，加水至刻度； （2）分别取 0.4,0.6,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8ml，各以补水至 2.0 ml； 13北京工商大学毕业论文（设计） 13 （3）加入 6%苯酚 1.0 ml。浓硫酸 5.0 ml，静置 10 min； （4）摇匀，室温放置 20 min 后于 490 nm 测光密度； （5）以 2.0 ml 水按上述操作做空白对照； （6）横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度，得标准曲线。 3 3、数据与曲线数据与曲线 项目数据 标准葡萄糖溶液（ml）0.40.60.81.01.21.41.61.8 吸光度值0.1110.2320.3310.4380.5380.6740.7630.870 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 y = 0.0068x - 0.101 R2 = 0.999 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 050100150200 亮 亮 亮 亮 µg亮 亮 亮 亮 亮 / 490nm 2.2.2 样品多糖浓度的测定 吸取样品液 1.0 ml，按上述操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。 2.3 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 法绘制蛋白制标准曲线法绘制蛋白制标准曲线 测定方法主要采用考马斯亮蓝 G-250 法。 2.3.1 标准曲线的绘制 1、溶液的配制、溶液的配制 （1）考马斯亮蓝 G-250 溶液：称取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 ml 95%乙醇，加 入 100 ml 85% H3PO4，蒸馏水稀释至 1000 ml，抽滤，避光保存。 （2）标准蛋白质溶液:50 mg 纯牛血清蛋白用 0.15 moll NaCl 定容至 500 ml，配置成 14北京工商大学毕业论文（设计） 14 100 ugml 蛋白溶液。 2、操作步骤操作步骤 （1）分别取牛血清蛋白溶液 0.2，0.4，0.6，0.8,1.0ml 置于试管中，补 0.15 moll NaCl 至 1.0 ml； （2）加考马斯亮蓝 G-250 溶液 5.0 ml，立摇匀，25 min 后于 595 nm 处测吸光度； （3）以 1.0 ml 0.15 moll NaCl 作空白对照； （4）以标准牛血清蛋白溶液作横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 3、数据与曲线、数据与曲线 项目数据 标准蛋白质溶液（ml）20406080100 吸光度值0.1420.2360.3200.3940.461 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 亮 y = 0.004x + 0.0718 R2 = 0.9954 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 020406080100120 亮 亮 亮 亮 亮 µg/ m l 亮 亮 亮 亮 亮 / 595nm 2