高效液相色谱法检测虾肉中硝基呋喃类药物残留 毕业论文.doc

钦 州 学 院本科生毕业论文（设计）高效液相色谱法检测虾肉中硝基呋喃类药物残留院 系 海洋学院 专 业 食品科学与工程(食品科学方向) 学 生 班 级 食品本081 姓 名 潘珍凤 学 号 0811402124 指导教师单位 钦州学院 指导教师姓名 蔡秋杏 指导教师职称 讲师 2012年4月高效液相色谱法检测虾肉中硝基呋喃类药物残留食品科学与工程2008级 潘珍凤指导教师 蔡秋杏摘要本研究采用高效液相色谱法测定虾肉中4种硝基呋喃类药物代谢物SEM、AHD、AOZ、AMOZ。样品加入三氯乙酸-甲醇和邻氯苯甲醛在40水浴条件下振荡提取同时进行衍生化12h，然后离心，将提取液pH值调节至7.0左右，用2倍体积乙酸乙酯萃取衍生物，氮气吹干溶剂后再用1 mL50%乙腈水溶液溶解残渣，高效液相色谱法检测，外标法定量。本方法简化了操作步骤，稳定性好，添加量在0.220nmol范围时，4种硝基呋喃类代谢物回收率在77.8%98.8%之间，相对标准偏差小于15%。SEM、AHD、AOZ、AMOZ的检测限分别为0.93ng/g、1.40ng/g、0.84ng/g、1.90ng/g。关键词：硝基呋喃类药物；高效液相色谱法；残留High performance liquid chromatographic method for detection of nitrofurans drugs residue in the shrimpsFood Science and Engineering 2008 Pan ZhenfengInstructor Cai QiuxingAbstractIn this study, the HPLC method was used for the determination of four nitro furan drugs metabolites SEM, AHD, AOZ, AMOZ in the shrimps. The different samples with acetic acid-methanol and adjacent chlorobenzene formaldehyde were bathed in 40water conditions at the same time the oscillation extraction for 12h,then centrifuged, adjusted the pH 7.0, with 2 times the volume of ethyl acetate extracted derivatives, and then with 1 mL50% acetonitrile solution dissolved the residue after nitrogen blowed solvent dry, and high performance liquid chromatography (HPLC) was used for the determination, external standard method was used for quotation. The method simplified the procedures, had good stability, with the addition amount in 0.220nmol range, four nitro furan kinds of metabolites' recovery range were between 77.8% and 98.8%, the relative standard deviation were less than 15%. The limit of detections for SEM, AHD, AOZ, AMOZ were 0.93ng/g and 1.40ng/g and 0.84ng/g and 1.90ng/g.Key words: Nitrofurans,HPLC,Residues目录1 前言11.1 课题研究背景11.2 硝基呋喃类药物的应用情况11.3 硝基呋喃药物的简介21.4 硝基呋喃类药物的特性21.5 硝基呋喃类药物在体内代谢31.6 硝基呋喃类药物及其代谢物的危害31.7 硝基呋喃类药物残留的检测方法及其研究进展41.7.1 高效液相色谱法（HPLC）41.7.1.1 高效液相色谱法的原理、特点41.7.1.2 高效液相色谱仪41.7.1.3 高效液相色谱法的研究进展41.7.2 超高效液相色谱法 （UPLC）51.7.3 液相色谱-质谱法（LC-MS）51.7.4 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）51.7.5 酶联免疫分析法（ELISA）61.8 课题研究目的及意义62 实验部分72.1 实验材料72.2 仪器与试剂72.2.1 仪器：72.2.2 试剂72.3 实验方法与步骤82.3.1 样品处理82.3.1.1 不同衍生温度的对比试验82.3.1.2 不同提取方式的对比试验82.3.1.3 不同提取时间的对比试验82.3.2 色谱条件92.3.3 相关系数、线性范围和检测限的确定92.3.4 加标回收率和精密度93 结果与分析93.1 衍生温度的确定93.2 提取方式的影响113.3 提取时间的影响133.4 线性关系、线性范围的确定143.5 检测限的确定163.6 加标回收率和精密度164 讨论195 小结与展望20致谢21参考文献22钦州学院本科毕业论文（设计）1 前言1.1 选题研究背景我国是水产品生产与出口大国,自20世纪80年代以来,我国的水产品产量一直居世界首位，然而制约我国水产业发展的突出问题,其中之一便是水产品的质量安全问题，其中就包括药物残留超标。目前常见的因残留超标引起水产品质量安全事件的药物主要有氯霉素、孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物和甲醛等,当人们食用了残留超标的水产品后,会出现不同程度的中毒反应,轻者影响健康,重者危及生命。而硝基呋喃类药物在水产品中的残留问题是近年来我国水产品出口中重点监控的项目1。中国是对虾养殖大国，但是近年来，硝基呋喃类药物残留超标事件仍时有发生。2008年1月22日，我国产速食虾就因检测出含有硝基呋喃而被欧盟食品和饲料委员会通报。在2010年度水产苗种质量安全监督抽查结果中，广东、海南、福建等地部分生产单位的虾苗、罗非鱼苗中检测出硝基呋喃类代谢物。硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，常用于治疗和预防沙门菌、大肠埃希菌感染引起的猪、鱼、禽类消化系统感染2，但是长时间或大剂量应用硝基呋喃类药物及其代谢物均能使动物体产生毒性作用，还有致畸致癌致突变的副作用。1.2 硝基呋喃类药物的应用情况在我国，硝基呋喃类药物曾经得到广泛使用。呋喃唑酮在畜禽养殖、水产养殖上应用非常广泛，曾广泛用于防治畜禽肠道感染、防治水生动物疾病。作为医药，呋喃唑酮用于治疗细菌和原虫引起的腹泻、结肠炎和霍乱等3。呋喃西林一般用作外用消毒药物，也有拌饵投喂防治水生动物疾病的报道4。从藻类中提取的卡拉胶(食品增稠剂)中也存在呋喃西林5。此外，硝基呋喃类药物也有可能添加到化妆品种以实现某些功效。由于硝基呋喃类药物及其代谢物具有毒性，目前国内外都对该类物质的使用控制相当严格。美国21CFR530.41规定：食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因。韩国2002年版食品公典规定猪肉中不得检出呋喃唑酮。欧盟EEC2377/9023规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃(包括呋喃唑酮)6。我国农业部于2002年将硝基呋喃类抗生素列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单(农业部公告193号)，从2003年开始，将硝基呋喃纳入残留监控计划中。1.3 硝基呋喃药物的简介硝基呋喃类药物主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮，是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，这类药物具有以下共同化学结构7：硝基呋喃类药物常用于治疗和预防沙门菌、大肠埃希菌感染引起的猪、鱼、禽类消化系统感染，具有高效抗菌作用和促生长作用。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，在低浓度下对上述病原体有抑制作用，高浓度则有杀灭作用，其抗菌作用机理是干扰细菌体内的氧化还原酶系统，使细菌代谢紊乱8。1.4 硝基呋喃类药物的特性呋喃西林，亮黄色结晶性粉末，难溶于水，微溶于乙醇，属于抗感染常用的药物，能干扰细菌的糖代谢过程和氧化酶系统而发挥抑菌或杀菌作用，其抗菌谱较广，对多种革兰氏阳性和阴性菌有抗菌作用，对绿脓杆菌抗菌力弱，对假单孢菌属及变形杆菌属有耐药性。呋喃妥因，难溶于水，微溶于乙醇，具有广谱抗菌性质，主要用于水产中疾病预防和治疗，对葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌等有良好的抗菌作用；对变形杆菌、沙雷杆菌等作用较弱；对绿脓杆菌无效。呋喃妥因内服吸收较快，体内消除快，此药由尿的排出量大，故主要用于治疗尿道感染。呋喃唑酮，几乎不溶于水和乙醇，其抗菌谱类似呋喃妥因，对消化道的多数菌有抗菌作用，此外对梨形鞭毛虫、滴虫也有抑制作用。该药具有性质稳定、价格低廉、不易产生耐药性、抗菌效力不受脓汁影响等特点。呋喃唑酮内服后难吸收，肠中浓度高而血中浓度低，故适用于各种肠道感染的治疗。1.5 硝基呋喃类药物在体内代谢呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮的代谢产物分别是氨基脲(SEM)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)。硝基呋喃类药物半衰期很短，在动物体内能迅速代谢9。但是它的代谢产物却能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的结合态，很难进一步降解，常用的食品烹饪方法如蒸煮、烘烤和微波加热等均无法使代谢物降解，清养数周后仍可在体内检测到，所以检测硝基呋喃类药物的代谢产物，更能起到监控作用10。呋喃唑酮进入体内后，代谢非常迅速。呋喃唑酮停药后12小时从组织中消失，而其代谢物AOZ在动物体内则以组织蛋白结合物的形式存在，在体内可残留数周，在停药后至少6周内AOZ在猪肌肉组织中继续存在。动物肝脏为主要的药物代谢器官，蛋白质结合态的残留药物主要累积在肝脏，呋喃唑酮残留研究常以肝脏作为残留靶组织进行检测。1.6 硝基呋喃类药物及其代谢物的危害硝基呋喃类药物及其代谢物具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变，有致畸胎的诱导作用，且能诱发癌症。硝基呋喃类药物的代谢物可以在弱酸性条件下(如人类胃液的酸性条件)从蛋白质中释放出来，因此当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害11。呋喃西林在该类药物中毒性最大，而呋喃唑酮是该类药物中最具代表性的一种。研究表明：蛋白结合态的呋喃唑酮残留物含有称为3-氨基-2-唑酮（AOZ）的完整侧链，在人胃的弱酸性条件下，侧链可以从蛋白结合态的母体分子上解离下来，AOZ可以代谢成为羟乙基肼，该代谢物是致突变和致癌化合物。同样硝基呋喃类物质的其他代谢物SEM、AHD、AMOZ也能在体内与细胞膜蛋白结合形成稳定的结合态长期存在，对人体产生毒副作用12。3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）作为呋喃唑酮的代谢物，其致畸致突变毒性已被证明，更重要的是AOZ不但能够与蛋白质结合后很难消除，而且释放一种诱导有机体突变的物质13。1.7 硝基呋喃类药物残留的检测方法及其研究进展现有动物体内硝基呋喃类代谢物残留的检测方法主要有液相色谱法，液相色谱_质谱法，液相色谱_串联质谱法和酶联免疫法，以及很少报道的高效毛细管电泳安培法14。1.7.1 高效液相色谱法（HPLC）1.7.1.1 高效液相色谱法的原理、特点高效液相色谱法是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而对试样进行分析。高效液相色谱法具备分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、检测器的重复性好、线性范围宽、分析速度快、操作自动化等特点，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物，还可用于各种离子的分离分析。1.7.1.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪的主要部件有：贮液罐、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。其基本的工作流程是：贮液罐中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来15。1.7.1.3 高效液相色谱法的研究进展葛宝坤12等采用高效液相色谱法快速测定鸡肉、鱼、虾中硝基呋喃类药物残留量，得到4种硝基呋喃类药物在3个不同水平的添加回收率为87%102%，检出限分别为5µg/kg、2µg/kg、3µg/kg、2µg/kg。景立新16等采用高效液相色谱法，检测海虾中呋喃唑酮残留量，得到检测下限为1.0µg/kg,回收率为89.7%94.7%。耿金培17等用高效液相色谱法检测饲料中的四种硝基呋喃类药物，得到呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因检出限为0.25mg/kg，呋喃唑酮的检出限0.12mg/kg，在添加浓度0.55mg/kg水平时平均回收率大于70%。刁石强18等用高效液相色谱法测定水产养殖底泥中呋喃唑酮残留量，得到回收率88.2%92.6%，检出限为1.0µg/mL。王蕾19等采用乙腈提取饲料中4种呋喃类药物，结果表明4种硝基呋喃类药物加标回收率大于70%98%，呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮的检测限依次为0.020、0.020、0.020和0.100µg/mL。1.7.2 超高效液相色谱法 （UPLC）据文献报道，一般饲料中硝基呋喃类药物的分析方法主要局限于液相色谱法，高效液相色谱法耗时较长并且消耗的溶剂量大，经济效益不高。超高效液相色谱法，可以补充高效液相色谱法的不足，还可以改善峰型，达到更低的检出限。彭莺20等人经MCX固相萃取小柱净化后用超高效液相色谱法测定，4种硝基呋喃类药物在0.125mg/L均与对应峰面积呈良好线性关系，添加质量浓度为0.25mg/kg、5mg/kg和100mg/kg时，回收率在79.6%85.5%之间，检出限为0.25mg/kg。李耀平21等采用超高效液相色谱串联质谱法检测烤鳗虾中硝基呋喃类代谢物残留，设计了4个添加水平，即0.2g/kg、0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg，得到四种硝基呋喃类代谢物的检测限均为0.2g/kg。1.7.3 液相色谱_质谱法（LC-MS）高效液相色谱配合质谱法具有定性、定量准确，抗干扰能力强，检测限低，测定快速，灵敏度高、选择性好、精密度高、易于操作和自动化的特点。近几年国内外采用HPLC-MS对各种药物及其代谢物的研究取得了一定的进展。徐维海22等采取HPLC-MS法研究呋喃唑酮及其主要代谢产物AOZ在罗非鱼体内的残留规律，利用该方法对呋喃唑酮及其代谢物AOZ的检出限分别为10µg/kg、1µg/kg。1.7.4 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）液相色谱串联质谱方法由于灵敏度高、可同时进行检测和确证，已被应用到各种食品中硝基呋喃类代谢物的残留测定。该方法操作简单，成本低廉，结果比较稳定。尹江伟23等用高效液相色谱_电喷雾三重四极杆串联质谱检测,4种硝基呋喃代谢物的线性范围为0.2525µg/kg，线性相关系数均在0.9985以上，4种化合物的检出限为0.03µg/kg。郭德华24等用液相色谱-四极杆串联质谱仪定性,同位素内标法定量测定动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量，检出限均为0.3µg/kg。孙言春25等人用超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留量，在2、20、100g/kg3个添加水平上，平均回收率在76.3%90.3%之间，相对标准偏差低于15%，最低检测限和定量限分别为0.25g/kg和0.5g/kg。1.7.5 酶联免疫分析法（ELISA）酶联免疫检测分析具有经济、快速、技术要求低，高度敏感性、特异性强、仪器设备要求不高，测定成本低等特点。沈美芳26等人利用酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留，最低检测限为0.3µg/kg，平均回收率超过96%。丁锴27利用化学发光酶联免疫吸附法测定水产品中呋喃唑酮和呋喃妥因的残留量，最低检测限为0.01ng/mL，IC50是0.8ng/mL，批间回收率在83103%之间，批内回收率在78113%之间。1.8 课题研究目的及意义硝基呋喃类药物具有广谱抗菌的作用，但是也有致畸致突变致癌和生物链传递等潜在危害。虽然我国以及国际上都已经禁止在食用动物中使用硝基呋喃类药物，然而由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，养殖业中滥用药物的现象还是普遍存在。因此建立并完善我国食品中4种硝基呋喃代谢物的分析方法，加强对我国进出口水产品的检验，开发该类药物在食品中的灵敏、稳定、可靠的检测方法就显得非常必要。本研究以对虾为研究对象，参考了农业部1077号公告-2-2008水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱法中的标准及方法，针对虾的特点对样品前处理进行了一些改进，用高效液相色谱法紫外检测器，外标法定量，方法回收率好，精密度高，适用于该类药物残留监控。2 实验部分2.1 实验材料基围虾，购于广州华润万家超市（客村店），实验前用匀浆机将虾肉捣碎，用塑料袋包装，置于-20冰箱中冷冻备用。2.2 仪器与试剂2.2.1 仪器：高效液相色谱仪：配紫外检测器（Agilent1100型，美国安捷伦公司）超声波清洗仪（Transonic TI-H 10，德国）恒温水浴摇床振荡器（MMV 1000W,日本产)氮吹仪（N-EVAPTM112，美国）匀浆机（东莞市塘厦兴万电子厂）旋转蒸发仪（N-1000,日本）超纯水器（Millipore中国有限公司）离心机：4500r/min（TDZ5-WS，湖南湘仪仪器公司）移液枪、分析天平、电子天平2.2.2 试剂三氯乙酸、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸铵均是分析纯，邻氯苯甲醛、乙腈、冰乙酸、甲醇均为色谱纯。标准品：呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃唑酮代谢物（AOZ），纯度99.5%（Sigma 公司出品)。提取剂(三氯乙酸-甲醇试剂)：称取11g三氯乙酸溶于100mL水中，加入100mL甲醇混合。衍生化试剂：吸取200uL邻氯苯甲醛，溶解于5mL冰乙酸和20mL甲醇混合液中。10mol/L NaOH溶液：称取400g氢氧化钠固体,溶于1000mL蒸馏水中。5mol/L 乙酸铵缓冲液：称取78g乙酸铵溶于100mL蒸馏水中。50%乙腈溶解：量取50mL乙腈于100mL超纯水中。标准储备液（200nm/mL）:准确称取硝基呋喃类代谢物标准品SEM 1.5mg、AHD 2.30mg、AMOZ 4.02mg、AOZ 2.04mg，用甲醇分别定容于100mL棕色容量瓶中，配成200nm/mL的标准贮备液。-18冰箱中保存。2.3 实验方法与步骤2.3.1 样品处理准确称取匀浆后的虾肉样品5g于50mL离心管中，加入20mL三氯乙酸-甲醇提取剂和0.5mL邻氯苯甲醛衍生剂，漩涡振荡混匀后进行提取，经一段时间后于4500r/min离心5min，取上清液。加入一定量10mol/L氢氧化钠和5mL乙酸铵缓冲液，加入50mL乙酸乙酯充分振荡萃取，静置分层后放出下层，上层液加入20mL蒸馏水，充分振荡，静置分层。取上层液体（乙酸乙酯层）在氮吹仪上氮气吹干，加入1mL 50的乙腈溶液溶解残渣，用0.22µm滤膜过滤，供高效液相仪器测定。2.3.1.1 不同衍生温度的对比试验在相同实验条件下，加入相同质量的样品，相同体积的提取液和衍生剂，用超声波振荡4h，探讨了温度在40、50、60的衍生效果，本试验通过比较三个温度分别和4种硝基呋喃类代谢物的含量的关系，确定最佳的衍生温度。2.3.1.2 不同提取方式的对比试验在相同实验条件下，加入相同质量的样品，相同体积的提取液和衍生剂，在衍生温度40提取4h的提取条件下，探讨了超声波提取和水浴振荡提取2种方法的提取效果，试验根据提取率的高低确定最佳的提取方式。2.3.1.3 不同提取时间的对比试验在相同实验条件下，加入相同质量的样品，相同体积的提取液和衍生剂，利用水浴振荡提取方法在40进行提取，探讨了不同时间：2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h的提取效果，根据提取率的高低确定最佳的提取时间。2.3.2 色谱条件色谱柱：Agilent SB-CN柱，250 mm×4.6 mm（内径），粒度5µm；（美国安捷伦公司）；流动相：乙腈(A)-磷酸二氢铵（B），V（A）：V（B）=3：7；流速：1.0mL/min；柱温：30；检测波长：295nm；进样量：20 µL。2.3.3 相关系数、线性范围和检测限的确定将硝基呋喃代谢物混合标准储备液，分别取0.2、0.5、2.0、10.0和20.0nmol的量加入20mL提取液和0.5mL衍生剂，每浓度做3个平行。40水浴振荡衍生反应12h，加入氢氧化钠和5mL乙酸铵缓冲液调节pH至中性，以50mL乙酸乙酯萃取，静置分层后放出下层，上层液加入20mL蒸馏水，充分振荡进行洗涤，静置分层。取上层液体（乙酸乙酯层）在氮吹仪上把氮气吹干，加入1mL50的乙腈水溶液溶解残渣，用0.22µm滤膜过滤，供高效液相仪器测定。计算各浓度对应峰面积的平均值，以平均峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x，做标准曲线，求出相关系数和确定线性范围。2.3.4 加标回收率和精密度取5g虾肉样品，分别添加0.2nmol、2.0nmol、20.0nmol三个不同水平的硝基呋喃代谢物混合标准液进行加标回收率试验。3 结果与分析3.1 衍生温度的确定不同温度下呋喃西林（SEM）、呋喃妥因(AHD)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃唑酮(AOZ)的衍生效果分别如图3.1、图3.2、图3.3、图3.4 ：图3.1 不同温度反应对SEM衍生物含量的影响Fig.3.1 Different temperature in different time on the amount of SEM content图3. 2 不同温度反应对AHD衍生物含量的影响Fig.3.2 Different temperature in different time on the amount of AHD content 图3. 3 不同温度反应对AMOZ衍生物含量的影响Fig.3.3 Different temperature in different time on the amount of AMOZ content图3. 4 不同温度反应对AOZ衍生物含量的影响Fig.3.4 Different temperature in different time on the amount of AOZ content结果表明，四种硝基呋喃类代谢物的衍生物在50和60条件下，含量会逐渐降低，而在40下则较稳定，不发生降解，说明了衍生反应温度不宜太高，40下进行衍生较合适，可在长时间内保持稳定。衍生反应速度较快，反应10min即可使4种衍生物含量均达到最大值。3.2 提取方式的影响在相同条件下分别采用振荡法和超声波法进行提取，四种代谢物的提取结果分别如图3.5、图3.6、图3.7、图3.8 ：图3.5 不同提取方式对SEM提取能力的比较Fig.3.5 The comparision of different extract mean to SEM content图3.6 不同提取方式对AHD提取能力的比较Fig.3.6 The comparision of different extract mean to AHD content图3.7 不同提取方式对AMOZ提取能力的比较Fig.3.7 The comparision of different extract mean to AMOZ content图3.8 不同提取方式对AOZ提取能力的比较Fig.3.8 The comparision of different extract mean to AOZ content从图3.5、图3.6、图3.7、图3.8四个图形可以看出，采用两种提取方法时，SEM、AHD、AMOZ的提取含量都相差不大，采用振荡提取AOZ时，提取效率则明显比采用超声波时的高。由于采用超声波提取时，一方面超声作用会造成发热而使温度不断升高造成衍生物的降解，另一方面长时间作用会对超声波仪器本身有较大的损坏。综合上述因素，本实验选用振荡提取方式。3.3 提取时间的影响在相同条件下，四种硝基呋喃类代谢物在不同提取时间的提取效果如下图3.9：图3.9提取时间与SEM、AHD、AMOZ、AOZ含量的关系Fig.3.9 The relationship of extraction time and SEM、AHD、AMOZ、AOZ结果表明四种硝基呋喃类代谢物在12h左右都能达到较高的提取含量，随后提取量基本上保持不变，为了节省时间，本实验选用的提取时间是12h。3.4 线性关系、线性范围的确定通过分别做5种不同浓度的呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃唑酮代谢物(AOZ)的混合标准溶液，得到以下4种硝基呋喃类药物的标准曲线，分别如图3.10、图3.11、图3.12、图3.13四个图形，4种组分的线性方程、相关系数和线性范围列于表3.1。图3.10 SEM的标准曲线Fig.3.10 The standard curve of SEM图3. 11 AHD的标准曲线Fig.3.11 The standard curve of AHD图3.12 AMOZ的标准曲线Fig.3.12 The standard curve of AMOZ 图3.13 AOZ的标准曲线Fig.3.13 The standard curve of AOZ表3. 1 标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围Table3.1 The regression equations、the correlation coefficient and linear range of standard curve组分回归方程相关系数（R）线性范围SEMy=19.869x-3.7020.99840.220.0AHDy=20.17x-4.2380.99760.220.0AMOZy=28.855x-4.4610.99920.220.0AOZy=32.979x-2.7470.99930.220.03.5 检测限的确定实验采用5.00g虾肉样品，最后定容到1mL，以3倍信噪比来计算，得到4种硝基呋喃类药物的代谢物的最低检测限分别为：SEM为0.9ng/g、AHD为1.4ng/g、AMOZ为1.9ng/g、AOZ为0.8ng/g。3.6 加标回收率和精密度采用标准添加法，在虾肉中添加3个不同浓度的4种硝基呋喃类代谢物进行回收率试验，每个组分做三组平行试验，试验结果如表3.2表3.2 添加回收率Table3.2 The add recovery组分添加浓度（nmol）回收率（%）精密度（%）123SEM0.2084.590.198.87.902.0096.690.189.52.2520.0082.792.182.86.28AHD0.2085.777.889.26.932.0092.389.991.91.4120.0082.384.578.93.44AMOZ0.2086.281.479.74.082.0098.387.785.47.6020.0083.284.281.91.38AOZ0.2085.192.597.56.802.0092.487.696.44.7620.0085.288.686.70.87从结果看出平均回收率在77.8%98.8%，3次平行测定的精密度在0.87%7.9%之间。按照以上加标回收率的方法，利用高效液相色谱仪得到硝基呋喃类代谢物混合标准溶液色谱图、空白虾色谱图、空白虾样品添加20nmol/mL硝基呋喃类代谢物色谱图分别如图3.14、图3.15、图3.16所示：其中四种硝基呋喃类代谢物的出峰顺序依次是SEM、AHD、AMOZ、AHZ。图3.14 硝基呋喃类药物代谢物标准色谱图（20nmol/mL）Fig.3.14 The standard chromatogram of nitro furan drugs metabolites(20nmol/mL) 图3.15 虾肉空白色谱图Fig.3.15 The blank chromatogram of shrimp meat 图3.16 虾肉加标色谱图，加标量2.0nmolFig.3.16 The labeled chromatogram of shrimp meat 4 讨论硝基呋喃类药物对光敏感，在生物体内代谢迅速，数小时内降解，无法检测，但是硝基呋喃类代谢物以蛋白结合物形态存在于机体组织中,只有在适当酸性条件下,通过水解才能释放出来。盐酸可以提供酸性环境，使其中的蛋白质结合物水解，得到代谢物，但是在提取过程中浸出杂质较多，不易排除基质干扰，且回收率不高。三氯乙酸作为蛋白质的沉淀剂，不但能使代谢物从蛋白质中解离出来，还可以沉淀蛋白，降低提取液杂质的含量，减少干扰。使用三氯乙酸作为提取剂比盐酸效果好，回收率更高。为了去除提取物中的水溶性杂质，采取液液萃取的方法，将被测物萃取到有机相中，进行初步净化。将衍生之后的上清液调至PH约7.0左右，然后用2倍体积乙酸乙酯萃取1次，该方法操作简单方便，不但可以节约费用，还可以得到较好的净化效果和回收率。在调节PH值时加入乙酸铵缓冲溶液，可以使溶液的PH保持在7.0且操作更加简便。样品经提取衍生后，离心取上清，沉淀中再加入少量三氯乙酸-甲醇溶液洗涤一次，合并提取液，回收率可提高10%左右。在利用氮气把乙酸乙酯吹干的过程中，由于液体的不断蒸发带走热量，会造成样液温度下降，从而使蒸发速度变慢，使操作时间延长很多。因此，为加快吹干速度，一般在水浴中进行，但水浴温度不能太高（上文实验结果以表明温度高会造成衍生物的降解），综合考虑水浴温度设为40。5 小结与展望本实验研究了高效液相色谱法测定虾肉中硝基呋喃类药物残留的提取和分析方法，采用三氯乙酸-甲醇作为提取剂和振荡提取方式，建立了合适的虾肉样品提取、浓缩的前处理方法，取得测定水产品中硝基呋喃类药物残留量较好的高效液相色谱条件。该方法在0.220nmol/mL定量范围内呈良好线性关系，检测限为1.0ng/g左右，样品回收率在78%98%之间。该方法操作简便，准确性高、重复性强，可检测出虾肉中硝基呋喃类药物残留，适用于水产品中硝基呋喃类药物残留的测定，具有一定的研究意义。目前，国内外对硝基呋喃类药物及其代谢物残留检测大多采用液相色谱及其联用技术，但是由于这种方法存在仪器设备昂贵、操作技术要求高、样品处理复杂和检测成本高等缺点，从而使其难以成为大规模快速筛选方法。然而国内外关于免疫分析法在硝基呋喃类药物及其代谢产物领域的研究应用报道相对较少，现有文献也主要局限于酶联免疫分析法。ELISA具有检测过程快速灵敏、操作简便、方法种类多和运行成本低等优点，还能达到当前国内外规定的最低检测限。因此在今后的研究中，免疫分析方法将会是研究者的热点，它也是硝基呋喃类药物残留检测的快速可行的办法之一，相信酶联免疫分析法将会在食品安全分析检测中得到迅速发展和广泛运用。致谢转眼之间，四年的大学学习生活就要结束了，回首往事，有太多的美好回忆，值得我一辈子去珍藏。我的毕业论文能顺利完成，首先要真诚地感谢我的论文指导老师蔡秋杏老师的关怀与帮助，因为她的用心与尽力，我们才有机会到广州南海水产所实习并完成毕业论文，而且蔡老师还在忙碌的教学工作中挤出时间来审查及修改我的论文。蔡老师不仅是我们的良师，还是我们的姐姐，她为人亲切善良，时刻为我们着想。在此，谨向她表示我最衷心的感谢的崇高的敬意！另外，我还要特别感谢南海水产研究所的老师以及师兄师姐们，尤其是邓建朝博士和辛少平师兄。邓老师从最初的定题，收集资料，到实验完成都给了我耐心的指导和无私的帮助。辛师兄积极帮我解决实验过程中遇到的各种困难，在论文的修改方面也给予了我较大的帮助，他对知识的渴望以及做事情的认真与耐心的态度深深地感染了我。最后，感谢我的班主任熊拯老师和戴梓茹老师，以及付满老师、陈美花老师、苗建银老师、钟秋平老师等等，他们在我的学习中都给予了莫大的帮助。还要感谢我的同学朋友们，尤其是曾祥震、唐玉凤、姚玉华、林娜、龙玉玲等同学，他们在我的论文完成过程中也给予了一定的帮助。感谢所有关心和帮助过我的老师们，同学们，朋友们！参考文献1 张清.水产品质量安全问题值得重视J.山东政报，2009，（5）：46-47.2 祝伟霞，刘亚风，梁炜.动物性食品中硝基呋喃类药物残留检测研究进展J.动物医学进展，2010,31(2):99-102.3 郭桢，连瑾，吴淑君动物源性食品