农学专业论文44572 (2).doc

本科生毕业论文（设计）题 目: 农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化 目 录摘要3关键词3Abstract3Key Words31 材料与方法41.1 材料41.1.1 植物材料41.1.2 菌株和载体51.1.3 培养基51.1.3.1 农杆菌培养基51.1.3.2 烟草组织培养基51.1.4 主要试剂51.2 方法51.2.1 农杆菌介导法转化烟草51.2.1.1 受体材料准备51.2.1.2 农杆菌的培养61.2.1.3 农杆菌侵染外植体及培养61.2.2 转基因烟草的分子鉴定61.2.2.1 转基因烟草DNA的提取61.2.2.2 PCR鉴定71.2.2.3 转基因烟草RNA的提取71.2.2.4 cDNA的合成81.2.2.5 RT-PCR检测82 结果与分析92.1 影响根癌农杆菌转化烟草的因素92.1.1 菌液浓度对转化效率的影响92.1.2 侵染时间对转化率的影响92.1.3 共培养时间对转化效率的影响102.1.4 预培养时间对转化效率的影响102.2 转基因植株的获得及分子检测（PCR、RT-PCR）112.2.1 转基因植株的获得112.2.2 转基因植株的分子检测113 讨论12致谢13参考文献13农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化摘要：利用农杆菌介导的方法将GmftsH基因转入三生烟烟草中，将0.5cm×0.5cm烟草外植体浸泡在培养好的农杆菌悬浮液中，震荡45分钟，然后置于MS1固体培养基上，在25的组织室内共培养2天，待再生幼苗根系发达后，将不定芽进行移栽从而获得了三生烟烟草转化植株。再经PCR检测，为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带，初步表明GmftsH基因已经转到这些烟草基因组中。最后通过RT-PCR反应进行阳性转基因植株GmftsH基因在转录水平的检测，在转基因烟草中能够扩增出特异条带，而在野生型烟草对照中没有检测到特异条带，说明该基因在RNA水平上得到表达。关键词：GmftsH基因；烟草；农杆菌；遗传转化；PCR鉴定GmftsH agrobacterium-mediated genetic tobacco genetic transformationAbstract：In the way of agrobacterium-mediated,putting GmftsH gene into Sansheng tobacco, then we make 0.5 cm x 0.5 cm tobacco explant soaked in cultivating good agrobacterium suspension, Concussing 4 to 5 minutes, then placed on MS1 solid medium, and Altogether training for two days in 25 organization indoor.After regeneration seedling root developed enough，transplanting adventitious bud thereby obtaining Sansheng tobacco conversion plants.PCR assay is the common way to validate the transgenic Plant, specific corresponding fragment was amplified by PCR detectionIt showed that GmftsH gene has been transferred into tobacco. Finally through RT - polymerase chain reaction, detecting positive GmftsH gene transcription of transgenic plants level, In transgenic tobacco could amplify specific bands, whereas in wild-type tobacco control in the specific band was not detected, indicating that the gene was expressed at the RNA level.Key words: GmftsH gene；tobacco；agrobacterium；transformation; PCR assay在植物基因工程中，目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方法便是根癌农杆菌介导的遗传转化技术。在已获得的近200种转基因植物中约有80是由农杆菌介导完成的1。近年来，这种纯生物的方法由于具有转化率高，可导入大片段DNA，且导入基因的拷贝数低，表达效果好，仪器和操作技术较简单等优点，引起了人们的极大关注2。该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传转化技术体系，为分子生物学和植物基因工程的研究提供较好的技术基础。而FtsH基因广泛分布于原核生物和真核生物中，其生物学功能也多种多样。FtsH基因与热激、高渗、光胁迫、冷诱导、病害等逆境胁迫有着不可分割的联系3-8，说明FtsH参与胁迫反应，但其确切的作用机制还不清楚，所以利用农杆菌介导的方法先将FtsH基因成功转入烟草中，可对FstH基因在烟草中的表达特性和生理功能的验证做良好的实验基础，为下一步的外源基因的遗传稳定性的检测也做了铺垫。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料烟草三生烟种子，将野生型烟草种子种植在营养土中，25条件下培养40-60天左右。1.1.2 菌株和载体本研究采用根癌农杆菌（EHA105）菌株为本实验室保存。植物过表达载体为pMDC-83，具有潮霉素抗性，可以进行初步筛选。1.1.3 培养基1.1.3.1 农杆菌培养基YEB培养基：酵母提取物（5g/l）+蔗糖（5g/l）+蛋白胨（5g/l）+七水硫酸镁（0.5g/l）+琼脂（15g/l）pH7.2。121高压灭菌锅灭菌 1.1.3.2 烟草组织培养基MS1（共培养）：即MS培养基pH7.2。121高压灭菌锅灭菌MS2（选择）：MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+头孢50ug/ml pH7.2。121高压灭菌锅灭菌MS3（生根）：1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 0.2mg/ml pH7.2。121高压灭菌锅灭菌1.1.4 主要试剂（1）植物生长激素：6BA 200ug/ml，IAA 0.2mg/ml（2）抗生素：Hyg 50ug/ml，Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，头孢霉素50ug/ml（3）TE缓冲液(pH=8.0)：1ommol/Ltris-Cl(PH=8.0) lmmol/LEDTA(pH=8·0)（4）氯仿:异戊醇：按体积比24:1混合平衡氯仿和异戊醇，放于棕色试剂瓶中，4保存。（5）电泳缓冲液TAE（50×）：每升含:242克Tris碱；57.lml冰乙酸；10Om10.smol/LEDTA(PH=8.0)(使用缓冲液为1×ATE)（6）植物总DNA提取试剂(2XCTAB，pH=8.0)：每升含：7.444克EDTA；12.114克Tris一Cl；80.2克Nael；20克CTAB1.2 方法1.2.1 农杆菌介导法转化烟草1.2.1.1 受体材料准备野生型烟草“三生烟”播种到营养土中，25培养40-60天左右。取完全展开叶片，将叶片先用灭菌蒸馏水清洗2-3次，再用70%的乙醇浸泡45秒，30%次氯酸钠或0.1%升汞消毒5分钟，转入超净工作台后用无菌水清洗4-5次，最后用灭过菌的滤纸吸干多余水分；用灭过菌的刀片将烟草叶片切为0.5cm×0.5cm大小作为外植体。注意：要保持叶片新鲜平整，切取外植体尽量避开叶脉9。1.2.1.2 农杆菌的培养(1) 挑取含有目的基因的单克隆，接种于YEB培养基上活化，单菌落接种于2ml的YEB液体培养基中（内含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28，200rpm振荡过夜。(2) 以1%的接种量接种于100mlYEB液体培养基中（内含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28，振荡培养至对数生长期（OD600=0.5）。(3) 无菌状态下，将培养好的菌液经过4000rpm(4)离心10分钟，弃去上清。(4) 用20ml的MS1液体培养基重悬菌体沉淀，4000rpm(4)离心10分钟，弃去上清(5) 用20ml的MS1液体培养基再次重悬菌体沉淀，然后冰上放置，准备侵染野生型烟草的外植体之用。1.2.1.3 农杆菌侵染外植体及培养(1) 侵染 将外植体放入上述（5）的菌悬液中，震荡4-5分钟，使农杆菌与外植体伤口部位充分接触，将外植体从农杆菌悬浮液中取出，置于灭菌滤纸上吸干，然后置于MS1固体培养基上（叶片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25的组培室共培养2天。(2) 共培养 将MS1培养基上的外植体转接到分化培养基MS2上（MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+头孢霉素），25光周期16h/18h，培养2-3周，其间每隔5天换一次分化培养基MS2，转接过程中注意要将叶片边缘侵入到分化培养基中，以便外植体吸收营养，而且转接当中要一直按照开始时转接的方式把叶片的光滑面朝上。(3) 选择培养 待愈伤组织分化成苗后用解剖刀切去整株的小植株转入装有分化培养基MS2的培养罐中，继续培养。(4) 生根培养 植株长大后，切去多余的愈伤保留整株的植株转入生根培养基中MS3（1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 0.2mg/ml），让其生根。(5) 待再生幼苗根系发达后，开盖培养2-3天强化整株后，取出植株用无菌水清洗掉幼苗根部的琼脂再移栽到灭菌土的盆钵中放置于室温中培养。(6) 注意观察再生烟草的生长情况，注意浇水，开关灯等。1.2.2 转基因烟草的分子鉴定1.2.2.1 转基因烟草DNA的提取采用CTAB微量分离法提取烟草DNA（1）在50ml 离心管中加入20ml 2×CTAB 提取缓冲液，65oC 预热。（2）取34g 新鲜的叶片，去掉主脉，在液氮中迅速研磨成均匀的粉末以后，把粉末倒入含有CTAB 缓冲液的离心管中，边加边搅拌均匀。（3）于65水浴保温0.5-1hr，并且加上40l 巯基乙醇，中间温和的混合几次。时间到后取出并冷却到室温，加入等体积(20ml)的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀10min（轻缓）。（4）室温下4，000rpm 离心10min，去沉淀，将上清液转入另一离心管中。（5）上清液中加入2/3 体积的异丙醇(20-30ml)，轻缓颠倒混和均匀，室温放10-20min。（6）离心去上清液(8，000rpm, 10min，室温)。（7）用4ml 75乙醇洗涤沉淀2 次以除去盐（置于-20冰箱放置过夜）（8）倒去75乙醇，37干燥(20min)，溶于600l TE buffer，转移至eppendorf管。（9）加入5l RNase(10mg/ml), 37保温30min。（10）用等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提13 次（视材料而定）（11）室温4，000rpm 离心10min，吸上清。（12）上清液中加入1/10 体积4M NaCl 溶液后，加入2 倍体积无水乙醇，室温放置20min 后，10，000rpm 离心5min，沉淀DNA。（13）沉淀用75乙醇洗涤23 次，干燥后溶入适量的TE buffer(50l)中备用。1.2.2.2 PCR鉴定用CTAB法提取得到的烟草基因组DNA为模板10-12，用GmftsH基因特异性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下划线标示为attB1位点)；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下划线标示为attB2位点)；进行PCR扩增，以野生型和ddH2O为阴性对照，含有目的基因的质粒为阳性对照。PCR反应体系20ul：Buffer(Mg2+)2ul，dNTP 1.6ul，Taq 酶0.2ul，上、下游引物各0.6ul，模板DNA 1ul，最后用ddH2O补足至20ul。PCR扩增程序：95预变性5分钟，94变性30秒，54复性30秒，72延伸2分钟10秒，共30个循环，最后72保温10分钟，随后12恒温。PCR电泳产物采用1.0%TAE琼脂糖凝胶电泳检测。对于PCR鉴定阳性的转基因烟草植株，下一步进行提取总RNA，进行cDNA的合成。最后通过RT-PCR反应进行阳性转基因植株GmftsH基因在转录水平的检测13-17。1.2.2.3 转基因烟草RNA的提取（1）采用天跟时代（TIANGEN）公司的Total RNA提取试剂盒进行RNA用的枪头、离心管浸泡在0.1%的DEPC溶液12个小时以上，随后取出高压灭菌。开始提取Total RNA之前，实验所用的镊子、小钥匙及研钵等均需在酒精中灼烧30分钟左右。（2）-80保存的大豆各组织材料放入小研钵中，加入液氮快速研磨至粉末，随后立即加入1000ul的裂解液RZ，在研钵中充分研磨。（3）取出研磨好的匀浆液，转入1.5ml的离心管中，15-30放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。（4）12000rpm离心5分钟（4），取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。 （5）加入200ul的氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置3分钟。（6）12000rpm离心10分钟（4），样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。（7）缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR中，12000rpm离心30秒（4），倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。（9）向吸附柱CR中加入700ul的漂洗液RW，室温静置2分钟，12000rpm离心30秒（4），倒掉收集管中的废液。（10）将吸附柱CR放入2ml收集管中，12000rpm离心30秒（4），倒掉废液。（11）将吸附柱CR转移到一个新的离心管中，加入30-50ul的RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟（4）。（12）将提取好的RNA进行电泳检测后放-80冰箱中保存备用。1.2.2.4 cDNA的合成cDNA合成依据TaKaRa试剂公司SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit II试剂盒中cDNA合成产品TaKaRa Code：DRR037A操作说明。反转录反应体系如表2-1表1-1 反转录体系试剂 使用量5×PrimeScript® Buffer 2lPrimeScript® RT Enzyme Mix I 0.5lOligo dT Primer 0.5lRandom 6 mers 0.5lTotal RNA 2ulRNase Free ddH2O up to 10l 反转录程序：反转录反应条件如下: 37 15 min（反转录反应） 85 5 sec（反转录酶的失活反应）反转录生成的cDNA采用烟草内参基因actin检测质量，并保存与-20。内参actin上游引物A1：5' CCTCAACCCAAAGGTCAACAG3内参actin下游引物A2：5'GACCAGCGAGATCCAAACGAA31.2.2.5 RT-PCR检测将反转得到的cDNA进行RT-PCR检测。引物序列采用GmftsH基因特异性引物：sence:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGGTTCTCTTCTTTATACGGA(下划线标示为attB1位点)；antisence: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTGGAGAGCTACACTACATTG(下划线标示为attB2位点)；RT-PCR反应体系为25ul。PCR扩增程序：95预变性5分钟，94变性30秒，54复性30秒，72延伸2分钟10秒，共30个循环，最后72保温10分钟，随后12恒温。PCR电泳产物采用1.0%TAE琼脂糖凝胶电泳检测。2 结果与分析2.1 影响根癌农杆菌转化烟草的因素2.1.1 菌液浓度对转化效率的影响在对农杆菌菌液的稀释过程中发现，菌液的浓度对叶片切口处芽诱导率有很大影响。分别将菌液稀释10、20、30、40倍，感染3mni后共培养3d，然后转入含潮霉素 50mg/L及Carb mg/L的FI分化培养基中培养18-20。表2-1农杆菌菌液的稀释倍数对抗性芽产生的影响菌液稀释倍数/倍 接种外植体数/个 死亡率/%10 52 98.2% 20 50 67.9% 30 55 3.0% 40 48 0实验数据表明稀释30倍的农杆菌所介导转化的叶片，分化出抗性芽的机率大;若稀释低于30倍，农杆菌浓度高，经过一个星期左右的选择培养后，潜伏的农杆菌会大量繁殖，对叶片造成污染，致使叶片死亡;而浓度太低，虽然腐化率降低了，但是因感染的强度不够，转化的成功率会降低。在既要求得到一定数量的存活外植体数又要保证一定的转化率减轻后续的筛选工作的情况下，选用30倍的农杆菌菌液稀释浓度为宜。2.1.2 侵染时间对转化率的影响用农杆菌LBA44O4菌液感染烟草叶外植体，在转化方法相同的条件下改变农杆菌浸染外植体的时间，分别以3-5min、6-8min、10-12min来进行，比较其对污染率和转化效率的影响。表2-2浸染时间对转化效率的影响感染时间/倍 污染率/% 平均出抗性芽数/个 3-5 0.4 2.9 6-8 22.3 4.5 10-12 100 0(注:污染率=污染的外植体数/接种外植体数平均出芽数:指未被污染外植体的平均出芽数)农杆菌浸染时间为35min时，外植体污染少，转化效率比较高;农菌浸染时间为68min时，平均每个外植体的抗性芽虽然增多了一些，可能是因为感染的时间变长后，农杆菌浸染植物细胞的几率增大了，但是外植体污染率也增加了22.3%;而当浸染时间达到1012min时，烟草叶外植体伤口变褐、腐化，最终由于农杆菌生长过于旺盛，选择培养基难以抑制其生长而使外植体全部被污染，完全不能转化。在既要考虑转化率又要考虑污染率的情况下，感染35min最好。2.1.3 共培养时间对转化效率的影响农杆菌浸染植物后，其T-DNA要转移并整合到植物体内需要一定的时间，所以，外植体感菌后还需在无抗生素的再生培养基上共培养一段时间,将其时间设为0d、3d、5d:表2-3共培养时间对芽分化的影响共培养时间/天 污染率/% 平均出抗性芽数/个 0 0 2.1 3 1.3 4.1 5 12.9 3.0由实验结果可看出，共培养3d的芽分化率比0d的要高一些，因为在这种情况下，感菌时间长有利于农杆菌的侵入，而共培养5d的外植体污染较严重，综合外植体污染情况及出芽率高低得出最佳共培养时间为3d。2.1.4 预培养时间对转化效率的影响一般认为，外植体的预培养可使伤口周围的细胞得以恢复，如愈合过程中分泌的酚类物质诱导农杆菌Vir基因启动;预培养可促进细胞分裂，调整细胞状态，减少伤害胁迫而有利于农杆菌感染。而处在分裂状态的细胞更易整合外源DNA;在高渗培养基上进行外植体预培养还可减少伤口处的细胞伤流液，使细胞内的液泡减少并使细胞产生一定程度的质壁分离，使农杆菌易于接触伤口周围的细胞。为了确定合适的预培养时间，将叶片分别预培养0d、ld、3d、5d后在相同条件下感染及共培养，试验结果如下表2-4预培养时间对抗性芽产生的影响预培养时间/天 0 1 3 5平均出抗性芽数/个 3.4 3.6 3.9 3.2由实验数据可知:当根癌农杆菌转化烟草叶外植体时预培养时间为3d，平均每个外植体出抗性芽数最多，转化的效果最佳。2.2 转基因植株的获得及分子检测（PCR、RT-PCR）2.2.1 转基因植株的获得将构建好的植物过表达载体转化农杆菌，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，潮霉素初筛后得到组培转化烟草苗，转化流程如图3-1。图3-1叶盘法转基因烟草流程图Fig.3-1 The vector was transformed into Nicotiana tabacum using the leaf-disc protocal2.2.2 转基因植株的分子检测为了检测目的基因GmftsH的整合性，提取转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA进行PCR检测。结果如图3-2所示，转基因植株中能够扩增出特异的条带，选取3条阳性条带测序，发现和克隆的目的基因序列一致，说明GmftsH基因已经整合进了烟草基因组中。对PCR检测呈阳性的转基因植株，提取总RNA样品RT-PCR分析以检测GmftsH基因的转录情况。结果如图3-3所示，在转基因烟草中能够扩增出特异条带，而在野生型烟草对照中没有检测到特异条带，说明该基因在RNA水平上得到表达。M P WT 1 2 3 4 5 6 7 8图3-2 转GmftsH基因植株的PCR检测M：DL5000；P：阳性质粒对照；-：ddH2O；WT:野生型；1-8：转基因植株Fig.3-2 PCR analysis of transgenetic GmftsH plantsM：DNA Marker；P：PCR result of plasmid of pMDC83-GmftsH；-：ddH2O；WT:Wide type；1-8：Transgenic plantsWT1 WT2 1 2 3 4 5 6 7 8图3-3 GmftsH转基因烟草的RT-PCR鉴定WT1-2:野生型；1-8：转基因植株Fig.3-3 Identification of the GmftsH transgentic lines by RT-PCRWT1-2:Wide type；1-8：Transgenic plants3 讨论在烟草组织培养过程中，本试验做预培养用的是营养钵育苗，不是直接用无菌苗在无菌操作台上操作、培养箱培养，污染经常发生。另外，若工作环境空气不清洁，超净工作台过滤装置失效，培养基及器皿灭菌不彻底，外植体带菌及操作违规等也都容易造成污染。在采用农杆菌介导法进行基因转化时，外植体的材料来源及其生理状态、感菌时间、菌液浓度、共培养时间、预培养时间等因素都会影响转化效果。苗龄对外植体再生能力的影响，是因为考虑到外植体的叶龄和生理状况对转化的影响较大，因为其再生能力不同对农杆菌浸染的敏感性不同。另外，分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的浸染最为敏感，故一般认为幼嫩的外植体比老的外植体好21.浸染时间对转化效率的影响较大。当外植体在农杆菌菌液中浸泡时间达到8一12min时，外植体全部被污染，完全不能被转化。可能是因为在菌液中浸泡时间太长，外植体因农杆菌毒害缺氧而软腐。可见，掌握外植体在菌液中的浸泡时间，有助于减少后继培养中可能造成的污染，并可减轻细菌对植物细胞的毒害作用。同时农杆菌菌液对外植体有一定的毒害作用，这可能与细菌过量分泌一些毒性物质有关。试验时，曾以不稀释的农杆菌菌液来浸染外植体，结果经未稀释菌液浸染的外植体全部褐化死亡，无转化芽生成。可以看出，当农杆菌菌液浓度较高(仅稀释10倍时)，决大部分的叶外植体都腐化死亡掉，而当农杆菌菌液浓度较低(稀释30倍时)，叶外植体都能存活并分化出芽。而在农杆菌感染外植体后，伤口处的细胞会因过敏反应而导致褐化，从而严重影响再生芽的分化频率和转化频率。而卡那霉素加入时间对转化作用影响很大，如果把感染后的外植体马上转移到含卡那霉素的选择培养基上，细胞很难在含有高浓度的卡那霉素上存活并诱导成芽;但共培养时间太长也不利于转化，当培养时间超过一周，农杆菌的大量生长对叶外植体产生抑制，并且在随后的培养过程中难以消除。本实验比较了共培养0d、3d、5d的效果，发现共培养3d为最佳共培养时间为。预培养时间对转化影响较小，实验结果表明，无论是经过3d的预培养的烟草叶盘，还是未经过预培养而直接侵染的叶盘，其出抗性芽数没有显著的差别，所以为了缩短转化时间，其实可以考虑省去预培养。本实验烟草转化植株的分子检测采用PCR检测，PCR是最常用的一种分子生物学检测方法，具有材料用量少，检测方便，适合于大批量样品分析等优点，是早期检测的好方法。PCR反应涉及到的因素有很多，而且对每个因素的条件都极其敏感22。其中模板的浓度和纯度、Tqa酶、引物、dNTP、退火温度对PCR反应的影响尤其明显，如果某个因素没有掌握好，会导致产生非特异性条带或产生的特异条带较弱甚至消失，因此在进行PCR扩增之前，建立一个合适的反应体系很重要。致谢：本研究工作是在导师XX教授精心指导下完成的。从论文的选题、整个实验的实施及论文的写作全部过程中，导师倾注了大量的心血。她耐心的指导、孜孜不倦的教诲、勤奋严谨的治学态度将使学生终生受益。值此论文完成之际，谨向恩师表示我最诚挚的感谢 本论文的主要工作是在XX，感谢学校所提供的完善的实验设备和实验材料，同时要感谢此过程中，XX学长所给予我的精心指导和热情帮助。最后我要感谢我的家人和朋友，是他们在物质和精神上给予我殷切的关怀和支持，才使我得以顺利完成学业参考文献：