本科毕业论文（设计）杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化.doc

杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化大 摘 要本研究以藤茶（显齿蛇葡萄）为原料致力于易于工业化生产的二氢杨梅素、杨梅素的分离纯化条件研究。建立和优化了二氢杨梅素的结晶重结晶条件，获得了较高纯度的二氢杨梅素和杨梅素。在此基础上，建立了高效液相色谱法测定杨梅素、二氢杨梅素的操作条件和藤茶总黄酮的测定方法。藤茶是一种非常古老的中草药资源、类茶植物资源和药食两用植物资源，其原植物为葡萄科蛇葡萄属的显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz) W.T.Wang）。其性凉，具利尿，消炎，清热解毒，散瘀破结,祛风除湿等功效，能医治肺痈、肠、瘰病、痈症肿痛、跌打、风湿、烫伤、肝炎、慢性肾炎、小便涩痛等疾病，并可治感冒、咽喉肿痛、胃热呕吐等症。藤茶主要成分为二氢杨梅素和杨梅素等黄酮成分。二氢杨梅素基本性质为白色针状结晶，mp: 245246,易溶于热水、热乙醇、丙酮、甲醇，微溶于水、醋酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚。显色反应为盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，三氯化铁反应呈紫黑色，与三氯化铝反应呈强黄绿色荧光；-萘酚反应阴性；与锆盐-柠檬酸反应鲜黄色不褪。杨梅素基本性质为黄色结晶，mp：324326，溶于甲醇、乙醇、热水，微溶于水，难溶于氯仿、丙酮、石油醚。显色反应为盐酸-镁粉反应呈玫瑰红色，与FeCl3乙醇液反应呈墨绿色，与AlCl3反应呈强黄绿色荧光，-萘酚反应呈阴性，与NaOH 反应呈黑绿色，UV(MeOH)：375.0nm，255.0nm。贵州藤茶黄酮含量可高达40%以上，藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）和杨梅素（Myricetin, MYR），美国FDA已将杨梅素广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品；而二氢杨梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效，广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂并已在制备抗白血病及鼻咽癌药物的应用领域取得了发明专利；是保肝护肝，解酒醒酒的良品，主要作为医药原料药并做为一类新药准备进入临床试验。研究了藤茶总黄酮的测定方法，以二氢杨梅素为对照品，在291 nm测定吸收度，获得标准曲线的线性回归方程为：y= 0.0441x+ 0.034，相关系数： R2=0.9992，建立了藤茶总黄酮的测定方法，用该法测定藤茶总黄酮含量，比用芦丁作标样测定结果更准确和符合实际，测定6月初采自贵州梵净山的藤茶中总黄酮成分含量达43%。杨梅素和二氢杨梅素在结构上仅存在2,3位双键的差异，现有文献中还没有采用常规溶剂法同时将二者纯化出来的报道。本实验经过多个方案综合，结合二者极性以及对丙酮溶解度的差异，先采用水煎煮法提取总黄酮，即称取干燥的藤茶茎叶100g，粉碎后加热煎煮提取两次，滤液放置在0-4环境下静置过夜，待析出黄色沉淀后，用乙醇溶解，去杂精制。然后减压回收乙醇，干燥黄色块状物，得粗黄酮。接着用丙酮作为提取溶剂回流提取总黄酮，得到二氢杨梅素的丙酮提取液，回收丙酮，黄色浓稠物用水进行重结晶，经多次重结晶后可得具有细针状的高纯度二氢杨梅素，并且在重结晶加热过滤操作中，在滤纸上存有大量黄绿色物质，将其收集干燥后保存。丙酮提取后的不溶性残渣采用乙醇-水（1:1）进行回流提取，将提取液进行浓缩，静置数日可得黄褐色沉淀。经提取分离后得到三个分离纯化产物，分别将其在甲苯-乙酸乙酯-甲酸10:8:5)和甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1)的展开剂中进行展开，与杨梅素和二氢杨梅素标准品斑点和Rf值比较，白色针晶所呈斑点与二氢杨梅素对照品斑点一致，同样对1%FeCl3乙醇液显紫黑色，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10:8:5）展开剂中，二氢杨梅素对照品Rf值为0.37，白色针晶Rf值为0.38，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1）展开剂中，二氢杨梅素对照品Rf值为0.59，白色针晶Rf值为0.57，白色针晶在两种不同比例的展开剂中所呈斑点单一；黄绿色物质，黄褐色沉淀和杨梅素对照品所呈斑点一致，遇1%FeCl3乙醇液显墨绿色，慢慢变为棕黑色，尽管斑点所显颜色与二氢杨梅素所显颜色有所相似，但对比之下，仍可区分。在不同比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂中，黄绿色物质所呈斑点单一，黄褐色沉淀中除有与杨梅素对照品相同高度斑点外，还有一个低于杨梅素对照品高度的斑点，且该斑点对1%FeCl3乙醇液显紫黑色，高度与二氢杨梅素对照品高度一致。在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10:8:5)展开剂中，杨梅素对照品Rf值0.54，黄绿色物质Rf值为0.54，黄褐色沉淀Rf值为0.55和0.40，在甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6:10:1）展开剂中，杨梅素对照品Rf值为0.60，黄绿色物质Rf值为0.60，黄褐色沉淀Rf值为0.61和0.49，盐酸-镁粉反应为鉴定黄酮类化合物常用的反应。经分离所得的产物经盐酸-镁粉反应后均呈紫红色。经薄层色谱和盐酸-镁粉显色反应以及前已述及的相关文献报道，可以初步鉴定出白色针晶为二氢杨梅素，黄绿色物质和黄褐色沉淀为杨梅素，但黄褐色沉淀中主要还含有二氢杨梅素杂质。鉴于二氢杨梅素样品和经重结晶操作首次得到的杨梅素样品在色谱行为中斑点单一，说明其纯度较高，故用高效液相色谱分别测定白色针晶物和黄绿色物质中二氢杨梅素和杨梅素的含量。用HPLC测定所得产物纯度，在如下色谱条件下：a 二氢杨梅素 固定相：Nava-pakC18柱，流动相：甲醇-水-磷酸（24:76:0.1) 紫外检测波长：294nm 流速：A泵0.24mL/min B泵0.76mL/min 总流速1.0mL/min 进样量：10L，柱温：30b 杨梅素 固定相：Nava-pakC18柱，流动相：甲醇-水（40:60，磷酸调pH) 紫外检测波长:254nm 流速：A泵0.40mL/min B泵0.60mL/min 总流速1.0mL/min 进样量：10L，柱温：30得到二氢杨梅素标准品保留时间为8.862min，峰面积为497388，二氢杨梅素样品保留时间为8.882min，面积446986；配制20g/mL的/杨梅素标准品和样品溶液经测定后，得到杨梅素标准品保留时间为6.117min，峰面积350885，杨梅素样品保留时间5.933min，峰面积306557。利用峰面积之比等于浓度之比可以算出二氢杨梅素样品的纯度为89.87%，杨梅素样品的纯度为87.37%。二氢杨梅素标准品和样品的保留时间大致相当，杨梅素标准品与杨梅素样品的保留时间相差不大。以上实验结果说明，通过水提醇溶法提取总黄酮，然后分别用丙酮、乙醇-水(1:1)提取分离二氢杨梅素和杨梅素，重结晶纯化后得到二氢杨梅素和杨梅素的实验方案切实可行，实验首次通过重结晶过滤操作得到的杨梅素样品含量为87.37%，这在现有文献中并无报道。用本方法可同时分离纯化获得杨梅素和二氢杨梅素，方法简单经济，操作容易、安全，获得的杨梅素和二氢杨梅素纯度高，经实验室放大实验验证工艺可行，为杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化和工业化生产提供参考。杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化摘 要贵州藤茶黄酮含量可高达40%以上，藤茶黄酮的主要成分为二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）和杨梅素（Myricetin, MYR），美国FDA已将杨梅素广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品；而二氢杨梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效，广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂并已在制备抗白血病及鼻咽癌药物的应用领域取得了发明专利；是保肝护肝，解酒醒酒的良品，主要作为医药原料药并做为一类新药准备进入临床试验。由于二氢杨梅素和杨梅素结构性质相近，在现有文献及专利中还没有采用常规溶剂提取法和重结晶纯化法同时将两者分离出来的报道。在参考杨梅素和二氢杨梅素各自现有的分离方法结合实验条件，采用水提醇溶法得总黄酮，再用丙酮对黄酮粗粉进行索氏提取分离二氢杨梅素，然后用乙醇-水（1:1）提取不溶性残渣分离杨梅素，最后用水重结晶法分别对两者进行纯化，首次通过二氢杨梅素的重结晶过滤操作得到纯度较高的杨梅素，经高效液相色谱测定，杨梅素纯度为87.37%，二氢杨梅素纯度为89.87%，这在现有各种文献中并无报道。研究了藤茶总黄酮的测定方法，以二氢杨梅素为对照品，在291 nm测定吸收度，获得标准曲线的线性回归方程为：y= 0.0441x+ 0.034，相关系数： R2=0.9992，建立了藤茶总黄酮的测定方法，用该法测定藤茶总黄酮含量，比用芦丁作标样测定结果更准确和符合实际。用本方法可同时分离纯化获得杨梅素和二氢杨梅素，方法简单经济，获得的杨梅素和二氢杨梅素纯度高，经实验室放大实验验证工艺可行，为杨梅素和二氢杨梅素的高效分离纯化和工业化生产提供参考。关键词：藤茶；二氢杨梅素；杨梅素；高效分离纯化；新方法；总黄酮；测定An Efficient method for Separation and Purification of Dihydromyricetin and Myricetin from Ampelopsis grossdentataAbstract The content of flavonoids from Ampelopsis grossdentata in Guizhou province can be up to 40%, whose main components are dihydromyricetin and myricetin. Myricetin has been widely used in medicine, food, health care products and cosmetics by U.S. FDA; dihydromyricetin has many effects, such as getting rid of free radical, antioxidant, antithrombotic, anti-tumor, anti-inflammatory, has been widely used to treat respiratory tract infections, alcoholism as Chinese medicine formulations, and has obtained patents in the preparation of anti-leukemia and nasopharyngeal cancer drug. They are good for protecting liver, alleviating a hangover and promoting awake, mainly used as a pharmaceutical raw materials and as a class of drugs ready to enter clinical trials.As dihydromyricetin and myricetin have similar structure properities, it's rarely reported dihydromyricetin and myricetin were obtained by conventional solvent extraction and recrystalization at the same time in current scientific literature and patents. After consulting current separation methods of myricetin and dihydromyricetin respectively, combining with experimental conditions, flavonoids were islolated from Ampelopsis grossdentata by taking hot water extract raw material, then the precipitate obtained from cold water solution with ethanol was dissolved, and the ethanol was easily removed by distillation to leave the total flavonoids. Crude dihydromyricetin could be separated by heating acetone under continuous reflux to extract total flavonoids, then with ethanol-water (1:1) to extract the insoluble residue to isolate myricetin. Finally, both were purified by water recrystalliztion. We can obtain rather high purity dihydromyricetin and myricetin through water recrystalliztion mathod. The content of myricetin is 87.37%, and dihydromyricetin is 89.87% by HPLC.With dihydromyricetin as reference, we studied the total flavone's measuring method from Ampelopsis grossdentata, measured OD at 291 nm, obtained the standard curve linear regression equation: y= 0.0441x+ 0.034, related coefficient R2=0.9992, established the measuring method of the total flavone's measuring method of Ampelopsis grossdentata, and determined by the total flavonoid content of Ampelopsis grossdentata. This method measures results more accurate and realistic than rutin as a standard sample.Dihydromyricetin and myricetin can be purified at the same time by this method which is simple, economical and no reported in the current literature. Meanwhile, this method can obtain high purity myricetin and dihydromyricetin, be verified feasible by laboratory amplification process experiments, and provide a reference for myricetin and dihydromyricetin efficient purification and industrial production.Keywords: Ampelopsis grossdentata， Dihydromyricetin，Myricetin，Separation and Purifition，High efficient method，Total flavone, Determination参考文献1 吴立军主编. 天然药物化学M. 第五版，北京：人民卫生出版社，2008.1-4.2 刘成梅等主编. 天然产物有效成分的分离与应用M. 北京：化学工业出版社，2003.2-4.3 中国科学院植物研究所. 中国高等植物图鉴(二册)补编M. 北京: 科学出版 社,1983.349-356.4 陈杖洲. 野生天然类茶植物代用茶野藤茶J. 广西热带农业,2003,(3): 27-28.5 张友胜,杨伟丽,熊浩平. 类茶植物显齿蛇葡萄的研究利用现状J. 茶叶通讯,2001,(1): 19-23.6 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编下册M.北京:人民出版社,1978.7 何桂霞,裴刚,周天达,等. 显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定J. 中国中药杂志, 2000,25(7):423-425.8 覃洁萍,梁山丹,何翠薇. 差示分光光度法测定广西瑶族藤茶中黄酮类成分的含量J. 中草药, 2002, 33 (7) : 607 - 609.9 何桂霞,何群,裴刚,等. 瑶族藤茶中总黄酮类成分的含量测定J. 湖南中医药导报, 1999,5(12):30-31.10 何桂霞,裴刚,周天达,等. 显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定J. 中国中药杂志,2000,25(7):423-425.11 熊皓平,杨伟丽,何国庆,等. 分光光度法测定显齿蛇葡萄总黄酮含量J. 食品科学,2004,25(2):144-145.12 张友胜,宁正祥,杨伟丽. 藤茶学M.广东科学出版社,2003.13 林淑英，高建华，郭清泉，等.二氢杨梅素的稳定性及其影响因素J. 无锡轻工大学学报，2004，23(2):17-44.14 王定勇,陈佳铭,章骏德,等. 显齿蛇葡萄(藤茶)化学成分研究J. 亚热带植物通讯, 1998,27(2):39-44.15 王定勇,徐素英.藤茶素的分离和构造确定J.漳州师范学院学报(自科版),1999,12 (2): 62-67.16 王定勇.藤茶甙的分离和结构的确定J.漳州师范学院学报(自科版),1999,12(4):42-45.17 张友胜,杨伟丽,崔春.显齿蛇葡萄化学成分的研究J.中草药,2003,34(5):402-403.18 薛慧.恩施来凤藤茶微量元素的分析及其保健功能探讨J.广东微量元素科学,2004,11(8):56-58.19 张友胜,杨伟丽,熊皓平.显齿蛇葡萄基本成分研究J.天然产物研究与开发,2001,13(5):46-48.20熊皓平,何国庆,杨伟丽,等.显齿蛇葡萄生化成分分析J.中国食品学报,2004,4(3):68-71.21 何桂霞,裴刚,杜方麓，等. 藤茶化学成分的研究J.中国现代中药,2007,9（12):11-13.22 张友胜,宁正常,胡闫勇 黄酮类化合物二氢杨梅素的研究现状J中成药,2002,24(12):971-97223 周天达，周雪仙. 藤茶中双氢黄酮醇的分离、结构鉴定及药理活性J中国药学杂志,1996,31(8):458-46024 何桂霞，裴刚，李斌,等. 二氢杨梅素的稳定性研究J.中国新药杂志，2007,16（22）:18881890.25 何桂霞，裴刚，周天达，等.瑶族藤茶中杨梅素的分离和结构鉴定J.中国民族医药杂志.2000,6（1）:40-41 26 陈缵光,王玫馨,蔡沛祥,等. 无刺根中蛇葡萄树和杨梅素的含量测定J . 中药材,1997 ,20(1) :23-24.27 王志江.杨梅素的稳定性研究J.广东微量元素科学.2008,15（10）:37-40.28 林淑英,张友胜,叶洪清,等. 二氢杨梅素在猪油体系中的抗氧化作用研究J. 食品科技,2003,(4): 71-73.29 唐瑛.藤茶总黄酮的体外抗氧化作用研究J.中国医院药学杂志,2006, 26(12):1449.30 周雪仙，湘华，李秋娥等江华瑶族防感藤茶的药理研究J.中国民族医药杂志,1996,2(4):37-3931 林建峰藤茶的抗炎作用研究J福建医学杂志,1995,17(4):39-4032 陈立峰,陈莉萍,徐琳本,等. 显齿蛇葡萄总黄酮对口腔常见致病菌抑菌作用的研究J.中南药学,2003,1(2):83-86.33孙志良,刘自逵,杨伟丽,等. 二氢杨梅树皮素的抑菌作用研究J. 特产研究,2003,(3):20-24.34 何桂霞, 李玲, 肖锦仁, 等.藤茶总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用 J .湖南中医学院学报, 2004, 24( 4) : 7- 8, 38.35 郑作文, 曾春晖, 林英辉. 广西藤茶中双氢杨梅树皮素对小鼠急性肝损伤的保护作用J. 广西中医学院学报,2002,5(3): 10-11.36 张秀娟,黄清玲,季宇彬.杨梅素的药理活性研究进展J.天津药学,2008,20(5):57-60.37 Liu IM, Tzeng T F, Liou S S, et al. 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