第五章 天然和重组蛋白质结构测定.ppt

,结构生物学,人类和其它有机体 基因组,世纪之交,后基因组时代的系统生物学,基因组,结构基因组学(Structural Genomics) ：基因组编码蛋白质组/群的结构与功能,蛋白质组学（Proteomics) ：生物体、细胞、组织中全部蛋白质的表达谱、相互作用、结构与功能,测序法,X射线晶体衍射,核磁共振,质谱技术,天然和重组蛋白质结构测定,蛋白质末端分析,蛋白质二硫键分析,二硫硝基苯甲酸 (DTNB) Ellman反应,在pH8.0时，412nm波长有强烈吸收,硫硝基苯甲酸,可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量,质谱,质谱方法(Mass Spectroscope,MS):可以正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究. 质谱方法仅限于小分子和中等分子的研究，因为要将质谱应用于生物大分子需要将之制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解成离子。20世纪70年代，解吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子。80年代电喷雾电离(ESI) 技术的发展则使得质谱方法应用于高分子量蛋白分子的研究,生物质谱技术,测定生物大分子三维结构的方法分为两大类：（1）应用X射线晶体衍射图谱法（X-ray crystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；（2）应用核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。,生物大分子三维结构的测定方法,美国蛋白质数据库(PDB)存入的三维结构数据, 至1993年6月为止总共存入1110套(其中,982套蛋白质、酶与病毒,107套DNA、2套RNA、9套tRNA和10套糖类), 而截止目前,已经存入国际蛋白质三维结构数据库的蛋白质、核酸和糖类的三维结构已超过20000套。 X射线晶体衍射分析迄今仍然是蛋白质和核酸空间结构测定的主要方法。以X射线晶体衍射分析为主要手段，加以NMR方法的不断突破，生物大分子三维结构测定在高速发展，19971998年间平均每日2个结构，而当前已达平均每日9个结构。,研究概况,X-射线衍射法概述,X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子的水平上了解物质。,X-ray diffraction,发展历史,1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1914年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的保利和科里提出，-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。,X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用,与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单,溶 菌 酶 （lysozyme),溶菌酶存在于鸡蛋清和动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。 溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。,鸡蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列,/nm,/cm-1,能量升高,电磁波谱与有机光谱的对应关系,X射线晶体结构分析,1) X射线 （X-ray）,1895年伦琴发现用高速电子冲击固体时，有一种新射线从固体上发出来,2) X射线晶体衍射学 1912年劳埃等人实验证实了X射线与晶体 相遇时能发生衍射现象，证明了X射线具有 电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个 里程碑。,当一束单色X射线入射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这些规则排列的原子间距离与入射X射线波长有相同数量级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射,X射线源,入射线,晶体,衍射线,X射线衍射原理,这种衍射现象貌似晶体中每个原子作为一个新的散射波源，它们各自向空间辐射与入射波同频率的电磁波。,因此，X射线在晶体中的衍射现象，可以看成是晶体原子的散射波互相干涉的结果。,晶体的衍射图,依据：在晶体结构分析中应用的X射线是波长在o1nm左右的电磁波，这一波长与晶体内原子间的距离具有同一数量级，由于晶体结构内分子排列的规则性，当X射线入射到晶体上时晶体中的每一个原子可发射出次生的x射线，并相互干涉，形成一个衍射花样。,对于x射线来说，由于不能将散射光聚焦而形成物像，来直接看到晶体内部的结构。但是，通过晶体的衍射花样反映处晶体内部的结构。,如何在衍射图与晶体结构之间建立起定性和定量的关系？,晶体结构基本常识,日常所见的许多晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。,衍射线空间方位与晶体结构的关系可用布拉格方程表示：,衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。,( n =±1,±2,±3,),Protein Structure By X-RayCrystallography,Obtain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z) ;Place poly-peptide chain into electron density.,Protein Crystallization and X-ray diffraction,X射线晶体结构测定步骤,蛋白质晶体的培养和挑选 X射线照射晶体，得到衍射数据 根据晶体性质，分析衍射数据，获得晶体晶胞空间群。 解晶体结构要进一步知道晶胞中原子的分布也就是原子坐标。这就需要结合其他方法，获得衍射点的振幅、相角、电子密度等信息，最终得到晶体结构。,晶体内部结构的特点：由于球状蛋白分子量较大，而且表面基团的构象较不稳定，欲获得排列有序的晶体是比较难的。实际上，所形成的晶体不可能是完美的堆砌，在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由占晶体体积一半以上（2070）的溶剂分子所占有，晶体的蛋白质分子之间通常是通过一个或几个无序的溶剂分子层发生接触，这些接触区域的相互作用也是较弱的。,获得好的晶体是 结构分析中最关键的一步,生物大分子的晶体要求,要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分析的晶体。 首先要得到具有有序性的单晶，不是孪晶，否则无法得到具有结构本身特点的衍射花样； 其次晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。,蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。 一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶核，并使分子不断地结合到晶核上，晶体逐渐长大。,过饱和溶液,蛋白质结晶过程是一个有序化过程,蛋白质结晶过程,晶体生长的理化条件,蛋白质晶体生长的生化条件： pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂 在摸索晶体生长的过程中，首先是缓冲液的选取，其次是沉淀剂，最后是蛋白质的浓度 蛋白质晶体生长的物理条件： 温度、震动、溶剂的清洁度、试剂的纯度、重力等因素 物理条件控制了晶核形成的速度和晶体生长的速度,在蛋白质结晶时必须保持在水合状态，或者在生理pH和温度条件下。 要使生物大分子结晶和生长出大的晶体最关键的是控制过饱和度的量和结晶速度过饱和度要低，而速度要尽可能地慢。,蛋白质结晶要点,单晶衍射分析应用,能提供晶体内部三维空间的电子云密度分布，晶体中分子的立体构型、构像、化学键类型，键长、键角、分子间距离，配合物配位等,a ribbon representation of Klebsiella pneumoniae nitrogenase component 1 臭鼻肺炎杆菌,Crystallization Robotics,Setup: small quantity, accurate, time saving, repeatable. Monitor: continuous, accurate, time saving, dynamic.,PROTEUM系统适用于生物大分子结构测定,核磁共振（NMR）,核磁共振是1946年由美国哈佛大学普舍尔(E.M.Purcell)小组和斯坦大学的布洛赫（F.Bloch）小组同时独立发现的，它的研究对象是原子核的磁矩在磁场中对电磁波的吸收和发射根据核磁共振峰的化学位移和自旋-自旋分裂可以测定分子的静态结构、 研究化学交换等,常见有机波谱,原子核由质子和中子组成质子、中子与电子一样具有自旋运动，因而核也产生磁矩,并非所有原子核自旋都具有磁矩，实验证明只有那些原子序数或质量数为奇数的原子自旋才具有磁矩例如：H，C，N，O等,让处于外磁场的自旋核接受一定频率的电磁波辐射（h ），而辐射的能量又恰好等于高低两种不同取向的能量差时，质子就吸收电磁辐射，从低能态跃迁到高能态而产生共振现象，称为核磁共振（NMR） 以吸收的能量的强度为纵坐标，以吸收的频率为横坐标，用记录仪描绘下来，分子中各个核在核磁共振谱上即出现吸收峰，成为核磁共振谱图,常规1D谱：1H-NMR ，13C-NMR ，DEPT (90o或135o) ，31P-NMR，19F-NMR,按照核磁共振所研究的样品体系，我们可以将核磁共振技术分为： 溶液高分辨核磁共振: 以溶液样品为研究对象，主要用于研究生物分子、药物分子和化学分子体系中的相关问题。 固体核磁共振: 以固体样品为研究对象，在材料研究以及高分子聚合物的分析中是不可缺少的研究手段。 核磁共振成像技术: 可用以获得人和动物体中各种器官以及骨骼的断面图像，现今已发展成为医学上重要的诊断工具。 三类核磁共振基于同一物理原理，但是实验技术各不相同，对实验样品制备也有各不相同的要求。,核磁共振的分类,核磁共振波谱仪,工作过程包含射频发生、 功率放大、脉冲形成及控制、信号检测等,核磁共振的发展,1971年比利时的J.Jeener首次提出二维核磁共振的概念。 20世纪80年代末期遗传工程技术迅速发展，已成功制备了许多15N和13C等稳定同位素标记的蛋白质样品，使二维异核核磁共振方法得以实施 20世纪90年代初期A.Bax等人提出了异核三维和四维核磁共振方法。已可用于确定分子量为15-25kDa蛋白质分子的溶液三维空间结构。NMR技术最大的优点在于它能对在溶液中和非晶态的蛋白质进行测量 多维核磁共振波谱技术成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维空间结构的唯一有效手段。近几年来异核核磁共振方法迅速发展，已可用于确定分子量为1525KDa蛋白质分子溶液的三维空间结构 （600MHz）,NMR实验步骤,生物大分子的NMR三维结构,金黄色葡萄球菌酶(SNase),蛇毒蛋白CobrotoxinII结构叠加图,X晶体衍射技术与核磁共振技术的比较,1. X光衍射 （80%） （1）要结晶 （2）有动态运动研究的前景 （3）可以分析很大的分子 （4）数据收集时间短（同步辐射） （5）数据分析相对简单 2. NMR （15%） （1）无须结晶，在溶液状态下分析 （2）蛋白的动态运动学研究 （3）30 kD 以下的分子（600MHz，大分子的局部研究） （4）需要做同位素标志，数据收集时间长 （5）数据分析相对复杂,生物大分子在晶体状态下的结构是否反映了在有机体内的真实结构? 回答基本上是肯定的。目前来讲，实验结果表明，大部分生物大分子的晶体结构(crystal structure) 接近于其用核磁共振技术测得的溶液结构 (solution structure)。 试从晶体的内部结构进行解释？,思考题：,