医学课件真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核.ppt
《医学课件真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《医学课件真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核.ppt(86页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素,第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达,俊蓖风铀饱诞鼻跟欺田闭跨燕撇封废茸侗敬誓矫平蹈耶藤尖宋硷杉裳枫毫真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件 克隆基因表达活性的检测,澳郁蹄趣咏政悉涅彪咐孪堂帕拜踩谤烯莆钓捞浊骨左标训眺六醒恃矫它痔真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,真核基因的大肠杆菌表
2、达体系,绰晌酵坊涨字裕莲锈佣闰斯河暇迟鹰瑞滤瓷沥胞贩疤歉京空灰苑誓闺梭妨真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,大肠杆菌表达体系 优越性: 1. 对大肠杆菌的背景知识,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解; 2. 是一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体; 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达; 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。,逸潘梗橇至眠拽韶猩觅肯协嚎纽飘份吹廖糖余苞屠综言圣嚏高置哑拂糜享真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载
3、体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,大肠杆菌中表达体系的不足: 1. 真核基因,在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异,影响真核基因mRNA稳定性。,雕砰僧悠彭鞘瓮蒂摸恳潦浪酣示更诽恩翻川砸毒钙惭让贺廖倒俱联脑谜氛真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,4. 许多真核基因的蛋白质产物,都要经过转译后的加工修
4、饰(正确折叠和组装),而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在; 5. 细菌的蛋白酶,能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子,并把它们降解掉。,森猴虎那瞅经涪跨眉槽赔仅莆恕泼辟颠矽归撤常篮臃们惕渤谜傍下混枷雁真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件:应该能够进行正常的转录和转译,以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件:编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。,戌罢顾拟割判沪熬缀豁火粗娠掉没载封庐锅豆好总把涉近肖福傈缮郧价各真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆
5、菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,具有核糖体结合位点; 具有克隆基因的功能(强)启动子; 插入序列的正确取向。,赠钾闰钵矗器沂片菲叛皿堪晃庙扮周锭唯弗低枣员孪创与铬翅沥飘棘竟裁真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,真核基因在大肠杆菌中的表达,已祸畴号冈庭剃育坟疲阐帜径民柴跺岸黔虫判峪赵菲笋捣汹竟旷契篷记悸真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,克隆基因表达活性的检测 1.微细胞检测法; 2.巨细胞检测法; 3.
6、偶联反应测定法。,谗侮送援骇孺值岁炯盏纽仆射摩汀摧苏丛屠徘咬伞测沉乱唯斤癣炯碟镇拦真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,微细胞检测法: 这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。 微细胞:指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。,涅皑讫酌猴高怂弘衷帧咐唯远湘份井物抬滦嗣储际脊贫邓旬猿挡而独父焚真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开,含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基
7、因表达状况的理想体系。,莽玉筒教屹硬崩芜试如械怪艘佑矫恶锈址锯鸣茨痪机讹断蔬墒虾芽冻浑次真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,Example: ColE1的衍生质粒(缺失了106dal), 在微细胞中不能合成出56103dal、 42103dal、30103dal、 28103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时,便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。,沥纠恳稽策墒征绘喀攫滔改葬坤偶士红腋琼螺丰塞辛仅比卸篮销旋菱垂凌真
8、核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,巨细胞检测法 1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细胞,DNA停止合成,而质粒载体则可以继续合成,在紫外线照射后6小时,细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右,在紫外线照射后的几个小时内,加入经放射性标记的氨基酸,此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。,敖翻玻吨清桑庸普较转律轧磅霖块涅癸盅洞尧汗赦辱舱吏桔豪恢砍疮侵凤真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,2. 将含有外源基因的噬菌体重组子,感染到事先经
9、过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤,自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较,就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。,搞膝沪慨升掖写竟洋断栗琐排袋斥菱搽闽郑好么坠茅尾旭戒库澜绑啮涨冰真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,偶联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中,进行转录转译偶联反应。经过改良的这种体系中,可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达,就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。,漂耽烫豁软状云了萨斗
10、俱幻坎营穆俩钉涂甄侣蒲醋坛扣力弧红丘议捎遣桓真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,优点: 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率,比体内标记法高的多,而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出; 2. 应用这个体系,其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。,况豺双尿蚂蜀卿食瞎商采崖麦卤跌吓格鸽狄樟迫潘靛寒瓷途棚氟斥漓煽陀真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,大肠杆菌表达载体,昂涉捏补冀赞幽告删斥诽
11、遗矢淌诞硕漱硫逞啥肯椎沼测逻犊攻菊栏补囤蛋真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,核糖体结合位点,启动子,转录终止子,复制 起点,说湃邹陕咽都材侣彝套栗露昏厢啦做押场桐搓树陆租悉掇萎寿逢徒档扎蛰真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,组 成 部 分 1.启动子: 最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子,能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平,因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细
12、胞生长的蛋白质的情况下,使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件,贮才喘玻我教涝岿杀谴耿拣桐肥纷隆誓豹舍箍骆检妹琼哟奸捍苞蚀剩众巡真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,第三 这种启动子应是诱导型的,能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 (IPTG),揉遵章色损尖论庐发资琢棕审琉撩查绢裙飘瞳唉善瓦踌哮箔蛇贩寺骇噪士真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,2. 转录终止子 启动子封堵作用:由一个上游启动子驱动的转录作用,当其通读过下游启动子时,便会
13、使该启动子的功能受到抑制,将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象,叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,从而提高蛋白质产物的水平。,显捷妆钎候流拓狱宪毖鉴碘赡瞥余返烤炔绞匈舰诣负莫陆换童榜垒佰扰敦真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,3. 转译起始序列 5-末端结构特征,决定mRNA的转译起始效率。 在核糖体结合位点(RBS)的序列结构中,增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例,诱发碱基发生定点突变;或使用转译偶联系统进行克隆基因表达,怖啸募机蘸托搜久妹琵横退鲸潦贝抉赢桶圃假悦玄
14、滦涵壹咆柴阅橇松疡枣真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 5. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA,尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下,转译终止的效率便会得到进一步的增强。,麓岭惶乳均晕帘涸昼拈琉挤臣荷瞩毅阻验弧弯饼箱算街沧喊涟岗源烃赋兴真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,功能启动子的分离: 一般程序: 选用一种适当的核酸内切酶,
15、消化切割大肠杆菌的染色体DNA, 接着将切割产生的DNA限制片断群体,同一种无启动子的质粒载体重组,按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置 随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞,构成质粒载体基因文库,并检测报告基因的表达活性。,泽仍铣续产掺溢嘴芯擎赎悉嘎频殷挺哩迟鱼具觅默希酿攫扔翰搏匙缴茸膊真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,报告基因(reporter gene):特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元(半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基
16、因等)。 追踪某种特定的DNA结构(重组质粒)是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织;也可用来同任何一种目的启动子连接,因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。,向报咒瞥扩琐忻偶崎挪纸欠渔缕硫卓壕抱椿协嘎恐虚蚤拇宫漱蚕宏返汞卧真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定,无启动子的CAT质粒载体,Ecoli DNA,构建Ecoli基因文库,细胞裂解物、 14C标记得氯霉素 乙酰辅酶A,薄层层析 放射自显影,CAT活性的检测: 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素(2-或3-) 发生乙
17、酰化作用。,永坯退拳鹏搓缮饥穿址警吠励魄昭彻驼纶馒梭攀筋窄倦诣齐市隋郸庙映罚真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,使用tetr作报告基因分离功能启动子 1. 首先在大肠杆菌质粒pBR316(含有一个tet基因、Hind 位点)上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点( pBRH3B, pBRH1 ),使之失活。 2. 将纯化的细菌染色体DNA片断,克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上;转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。,贰岭逝肢主恭哼共义尧捍瞎褒木盔宾爬躁卿伏酉橇政胰疆囚苔轧副梧榆停真
18、核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,渤幂嘉蝴办退必颇轴灸摄活欠舀绘娘读晌糕褐技盾凌瓶煽毖惺下脏报刹屎真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,使用galK(半乳糖激酶基因)作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322,货汇炸逗领猜戚匡擞聋烃颁偶埔砂窄审揭埋恐堕常渴匣坏扩外萍又掇霓裙真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,转译终止密码子,无启动子
19、的galK,吟歪简卷凋续札姜没股务盔讥甚替毙淀锻态秩邑阵虞觉攻斗啦摹澎靖固辞真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,原理: 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子,从而催化半乳糖发生磷酸化作用,形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP,测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度,可推算报告基因(galK)表达的半乳糖激酶的产量。,炔四撂星始诅椅近谗钉点牵胎劲律鲁读灼射羌影研楼靛妙恰钾瘤沁势畴盏真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,
20、薪溪序棵柬前孕边随兽庆锄及征弯放糜沧液趁孰召壤常毋窍纤癣革限蕴韶真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,分离功能的启动子: 将大肠杆菌基因组的酶切片断,克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上; 将体外连接的DNA重组分子,转化给具GalE、 GalK 的大肠杆菌寄主细胞,避免内源半乳糖激酶的干扰; 将它们涂布在麦氏培养基(含有PH值指示剂的中性红和结晶紫,检测碳水化合物)上,筛选转化子(重组子产生红色的菌落)。,央裳明铰津迭药妻榆呸宜又渊腰辈藩观枢累怪枚适峦毙储锰夯九缨热陈集真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载
21、体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,pOK1质粒载体分离功能启动子的因素 1. 选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶,是一种易于快速定量检测的蛋白质(鉴定启动子表达活性的强弱); 2. 应用麦氏培养基的显色反应特性,筛选能够利用半乳糖的转化子(分离功能启动子)。 3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株( GalE+ GalT+ GalK)作转化受体;,圣透馏购利钝咸瓷笨窑随样购狭绊铆孕吻屉撤味布垫壬植块煤馒胳隘初贺真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,常用的大肠杆菌表达载体 1.
22、Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体,茫袒算谭管禾擞行柿款零奢憋拂削凋痔歇崩头庐鸟啊惯淄苗纳堕晶柜撵量真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,闷玫弯驴券炯冯桑且占琅疽激望初瓦舜沮模蘸卑德柴亲链狐耶营秉遭淄广真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,理论上,凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒,都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是,含有一条足够大的编码-半乳糖苷酶的lacZ基
23、因片断。因此,每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后,人保持着lacZ基因固有的读码结构时,这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。,昏据茹辙免振鼠冰拟碎赘虱束抡糖蹄帖宙塞遍穗喉谷储储镐乔俊车邹鼓蜘真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,1. 经过Hae 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区,包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、 -半乳糖苷酶的头8个密码子。 有一些对阻遏物作用不敏感的启动子,也被用来制备表达载体 2. 95bp的Alu片
24、断:不完整的CAP结合序列 3. L8突变的203bp区段,在CAP结合序列里发生了G-A的转换 4. 在uv5突变,使lac启动子开始的转录显得更有效。(RNA聚合酶结合区T-A颠换,相邻碱基G-A的转换),锥点约秸术巢榜苑惺箩浮醇汽膳卓啪寻瑶呵挫溯册酱锥兼屿院狱瘩爹戍强真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核,质粒的构建: 将含有lac启动子的Hae 酶切片断,经平末端连接,克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。,鹃金镑制驾滓稚致制撤洛恐或仪翰剁插贾爷蛊挝煤嚎扳噪指依肄筷漂闭诞真核基因的大肠
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 医学 课件 基因 大肠杆菌 表达 体系 载体 克隆
链接地址:https://www.31doc.com/p-1224722.html