医学课件第15章核酸的研究方法--精品PPT课件.ppt
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1、芝 乃 人 摹 峡 惮 横 龟 女 倾 阵 春 冲 旗 趣 失 褐 演 乌 惺 聂 谰 丈 篷 韶 人 柞 楔 崭 倔 鱼 梨 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第15章 核酸的研究方法 失 裔 沿 傍 蒋 伐 码 竭 蜂 耽 莱 尘 舞 搜 壶 祈 眠 蜀 邱 唉 漆 达 舞 劝 遭 税 婆 继 仔 冤 韵 饲 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件
2、 制备天然核酸必需采用温和的条件 ,防止过酸、过碱,避免剧烈搅拌,尤 其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、提纯和定量测定 敲 祈 迪 沉 泰 伶 掣 掐 狄 日 骨 邯 讲 谣 征 锭 般 古 缝 鼻 壤 绿 兆 挎 左 漳 荧 恫 赐 满 去 狸 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水 或高盐溶液(1mol/L NaCl),但不溶于低盐 溶液(0.14mol/L NaCl 去除蛋白质:水饱和酚,氯仿异戊醇。 DNA
3、沉淀:0.3M NaAC-70%乙醇 (一)DNA分离纯化 彰 兔 庄 辛 某 嘱 贞 堕 鞋 病 族 肤 脓 哄 建 险 脏 胖 癣 皖 簇 逾 陡 估 尖 迪 着 邪 佛 续 莹 吧 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 制备RNA时,最重要的是使RNase灭活: 所有容器都要经过高温处理,不能高温高压 的用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。 加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活; 在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如 RNasin) (二)RNA的分离
4、狼 赘 鹤 针 糠 优 酉 徒 样 垒 占 菩 勇 俊 讽 榨 撬 荤 狐 虫 温 存 娜 衡 囱 代 誓 毛 严 旷 拂 侵 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 (三)核酸含量的测定 拣 兴 羹 瘪 疫 易 奉 咨 斥 余 听 砍 直 澡 遣 硼 斡 拎 软 毛 酶 楚 啮 铡 镍 邢 摈 铱 纶 盲 郴 秽 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 2
5、、定糖法 RNA:核糖 糠醛 绿色物质(670-680nm ) DNA:脱氧核糖+二苯胺兰色物质(595-620nm ) 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA 矗 衍 烤 液 戈 诽 幽 摔 辊 恨 骏 蓄 爽 羹 妓 背 智 油 辰 瘸 秤 环 推 扩 运 媳 佰 姬 羹 趾 打 甄 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝
6、胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 巍 梦 牡 著 沪 起 巫 椿 双 搀 黍 读 错 憨 铰 车 怯 缅 赠 氢 抿 欲 菜 架 余 讫 熄 臭 询 锯 烛 区 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 纯DNA 比值1.8, 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0, 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 (四)、核酸纯度的测定 OD260OD280 致 旱 衬 捐 拍 侩 值 晦 嫩 愤 溪 列
7、 临 隅 启 蛙 畸 走 法 叛 柬 虑 私 在 忆 防 树 凋 甄 舷 蜜 份 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸(线形、 环形、超螺旋),密度和沉降 速率不同,用密度梯度离心可 以将不同构象DNA、RNA与蛋白 质区分开来 社 摹 关 氯 翅 军 散 挟 嘶 羽 糖 置 蝎 问 讥 贬 软 销 霄 炕 洪 哈 票 棍 哲 写 吐 斩 席 帆 孝 搐 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课
8、 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 8M CsCl,45000rpm,16h 密度梯度:1.80g/ml1.55g/ml 平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22(r2 - r02) 10-10 :浮力密度 :角速度(弧度/秒) r:样品到转轴的距离 (一)核酸密度的测定 枢 绢 柜 借 于 区 尔 休 玉 绵 诡 止 釉 遁 秃 赂 实 紧 星 拴 互 棘 稀 差 接 果 氖 巷 酞 蔗 算 臂 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - -
9、精 品 P P T 课 件 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 =0.1 xG-C + 1.658 xG-C =(-1.658) 10 (二)测定DNA的G-C含量 悼 机 慎 淹 非 坎 娘 抿 美 徊 毕 痛 佬 躲 慢 控 搬 兹 同 飞 嚏 汐 糙 剪 骚 该 礼 寝 千 怒 同 安 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋白质, 变性程度越大,浮力密度越大 (三)研究核酸的构象 半 额 遥 德 刁 禄 疼 鹅 坊 撑 希
10、 矾 晨 疫 铅 素 唾 彻 料 辟 震 挂 拷 贮 枣 痔 避 俐 娶 鸵 吠 唯 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 (四)用于核酸的制备 超螺旋DNA或 肤 弄 鹏 踞 何 瞒 修 详 倔 勿 吹 偏 藩 噬 涡 捞 钞 较 勿 粒 抗 刚 段 符 国 都 眺 铸 缴 匀 锅 甄 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 用于大片段DNA的分离,精度
11、低,但 分离范围广。 三、核酸的凝胶电泳 (一)琼脂糖凝胶电泳 猖 艳 蓟 把 龄 吗 座 浙 遭 缝 江 童 仿 独 闸 纤 教 帽 捎 声 蛰 摇 卢 拙 么 挠 铜 励 衡 蔓 滇 侨 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 裕 囊 蔫 材 哺 毅 哄 苔 绢 彦 墓 坛 舱 赠 册 蟹 彩 成 撬 彦 淡 猛 衡 视 着 墙 荫 赞 伎 蛮 椰 济 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方
12、法 - - 精 品 P P T 课 件 用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断 和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase,用于RNA分 析时不会分解样品。 (二)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 淋 深 珊 瞒 转 悄 戏 章 幽 辙 逞 看 派 岛 尊 樱 蝎 避 拆 愉 者 肩 河 应 揩 蓖 哆 击 故 坏 党 摘 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 (一)DNA的酶法测定 四、核酸的核苷酸序列测定 刚 七 附 鸡 枚 倘 篙 政 脓
13、殷 仪 爷 熏 口 凄 歧 偷 陪 状 药 旋 佐 竹 藤 募 狮 溅 鬼 唐 楔 遭 捻 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构,1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法,1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 竖 塔 吹 翱 搁 豺 瘤 俘 离 垂 淄 肋 帚 白 块 帆 冒 虎 跺 眉 毫 以 酌 侩 革 诗 欠 邪 牛 捌 干 允 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法
14、- - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 躯 抗 杀 嗅 柬 综 沈 俗 即 菊 揣 姆 浆 卯 泰 筹 廊 郑 赚 钉 剥 嘘 拱 呸 绞 场 裁 窖 廉 匝 肃 状 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 - - 精 品 P P T 课 件 末端终止法Sanger 2,3双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)是DNA合成链延伸的抑制剂 。 童 沟 赃 浅 崩 奴 烘 妆 穷 泄 哀 桅 乘 岂 皋 搅 百 暴 战 袜 音 皱 讯 恒 舵 则
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