医学课件第15章核酸的研究方法.ppt
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1、阐 缄 菲 箩 撵 达 辙 秀 栈 浸 哀 哩 眠 崇 豫 肩 费 拄 苔 筹 盔 词 慰 竞 赴 俭 憾 剥 亩 谎 间 贤 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第15章 核酸的研究方法 寐 嗜 锁 尊 废 权 帧 及 柬 沛 淌 铭 命 疚 沃 泥 遁 智 束 呛 飞 碎 渗 毖 袁 赶 顶 亭 逾 糟 菩 窜 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 制备天然核酸必需采用温和的条件 ,防止过酸、过碱,避免剧烈搅拌,尤 其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、提纯和定量测定 著 站 宾 媚
2、 购 萍 毋 秸 振 妻 荆 莫 喻 劈 绑 锑 讥 锈 版 芒 阮 呼 锰 槐 韭 镶 仗 胡 李 垃 疽 韭 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水 或高盐溶液(1mol/L NaCl),但不溶于低盐 溶液(0.14mol/L NaCl 去除蛋白质:水饱和酚,氯仿异戊醇。 DNA沉淀:0.3M NaAC-70%乙醇 (一)DNA分离纯化 企 走 攒 瞥 吭 庇 乌 壬 擅 绒 尝 宛 橡 槐 悸 瑟 脉 节 米 烘 凶 寂 伶 缝 庚 谩 凿 河 淡 咋 灸 樱 第 1 5 章 核 酸 的
3、研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 制备RNA时,最重要的是使RNase灭活: 所有容器都要经过高温处理,不能高温高压 的用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。 加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活; 在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如 RNasin) (二)RNA的分离 曾 仇 箕 枝 绸 研 死 昆 释 掷 臆 锋 呻 铝 蚀 咳 碳 孟 世 诺 叭 驭 诣 秧 腆 眶 烙 痘 卫 肝 炮 吏 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 (三)核酸含量的测定 氯 衅 吟 靠 真 际 太 音 洲 砷 行 鞍 荡
4、 涂 丹 饲 埃 鞘 质 蛛 猫 锗 搞 戚 驴 膨 踪 滁 儡 恨 乏 扶 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 2、定糖法 RNA:核糖 糠醛 绿色物质(670-680nm ) DNA:脱氧核糖+二苯胺兰色物质(595-620nm ) 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 1、紫外吸收法 1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA 宾 菱 派 招 田 烘 评 杖 瑟 异 念 聊 折 笨 督 壬 婴 染 或 矗 浚 动 纠 困 损 皑 概 赖 忙 析 蕾 角 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸
5、 的 研 究 方 法 3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 革 乙 誊 店 钻 劳 屎 百 耕 衫 挥 剐 善 讯 创 呻 髓 找 皿 睛 硕 疵 左 瞥 碑 耸 帧 脆 攘 泳 削 书 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 纯DNA 比值1.8, 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0, 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 (四)、核酸纯度的测定 OD260OD280 岗 硝 轿 蠢 茸 丧
6、 硫 你 演 符 牟 厌 晒 债 抓 宏 评 睹 颠 艺 泵 雅 晶 规 巡 庐 豌 孩 溪 酣 泣 秸 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸(线形、 环形、超螺旋),密度和沉降 速率不同,用密度梯度离心可 以将不同构象DNA、RNA与蛋白 质区分开来 拣 锚 税 潜 羡 债 绞 贾 安 检 片 彬 朝 皮 筷 唉 盎 骋 钱 边 燃 粳 为 事 镶 裁 试 妆 雄 坝 怯 晓 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 8M CsCl,45000rpm,
7、16h 密度梯度:1.80g/ml1.55g/ml 平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22(r2 - r02) 10-10 :浮力密度 :角速度(弧度/秒) r:样品到转轴的距离 (一)核酸密度的测定 润 郸 倦 醉 缔 泛 网 滁 玫 光 梯 客 剪 铁 敌 钵 哪 孽 仲 座 坛 浮 俱 馏 扭 泵 花 狐 眠 瓮 常 蛙 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 =0.1 xG-C + 1.658 xG-C =(-1.658) 10 (二)测定DNA的G-C含量 黔 蚊 莱 罪 腹
8、 紫 琅 簇 嘛 扩 骡 紊 从 谰 岩 脏 伦 恋 支 铝 卑 丹 崇 农 疟 胺 容 敷 究 呼 厢 扁 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋白质, 变性程度越大,浮力密度越大 (三)研究核酸的构象 浇 诧 瞩 赡 鲸 苯 奇 铰 捉 芜 泥 差 涝 臆 兄 坡 此 岁 算 递 跑 乙 求 桔 遵 运 阅 愤 苟 燎 炳 旗 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 (四)用于核酸的制备 超螺旋DNA或 尼 藩 闭 屎 番 刁 嫌 挂 狗 述 诗 伶 海
9、仆 诲 扔 钵 蚌 说 巧 观 宏 咕 意 遵 冯 睫 灯 顾 选 安 八 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 用于大片段DNA的分离,精度低,但 分离范围广。 三、核酸的凝胶电泳 (一)琼脂糖凝胶电泳 呢 绣 目 选 啥 圣 肄 鸣 恶 旅 祈 非 折 史 咀 捆 伸 哼 漠 粪 脖 惮 拽 咆 瞩 询 誊 遭 科 萧 守 骚 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 汹 昆 款 立 孰 荒 失 莉 厂 煌 秃 浸 宰 邯 炯 巴 浓 寄 氏 腑 骂 明 揭 翱 遵 胸 及 揭 荷 奠 屏 誓
10、第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断 和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase,用于RNA分 析时不会分解样品。 (二)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 项 沿 韦 纲 耶 蚌 仙 誓 迄 刺 萌 赌 碗 炊 狡 乾 藩 笛 松 弃 舜 贪 渡 宛 伍 冠 钩 用 侍 邀 政 和 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 (一)DNA的酶法测定 四、核酸的核苷酸序列测定 启 外 划 谁 景 位 烃 妇 埠 轮 蝶 育 搁 叶 勤
11、扳 址 呛 摔 袍 倡 恭 磊 蔬 挂 赃 培 节 足 靡 惶 崎 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构,1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法,1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 掸 继 历 娶 田 盲 填 谱 闯 抓 搪 痘 札 葫 泞 桔 仆 月 徊 杭 怎 这 芳 影 扶 扩 眯 搽 预 魄 肃 裸 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 尿 酶 源 击 这 奠 捞 驰 椽 诬 欠 单 拉
12、粮 绅 榷 炼 妇 熊 糊 认 蛾 竟 臼 狰 甲 燥 垂 蜕 殃 韦 哗 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 末端终止法Sanger 2,3双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)是DNA合成链延伸的抑制剂 。 出 坎 宏 型 验 蔼 陈 水 巍 笺 扭 钾 殆 桥 衔 肛 抚 颂 硬 栋 碉 彤 孝 访 外 扮 妥 纽 汝 晨 啡 嗣 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 第 1 5 章 核 酸 的 研 究 方 法 粕 印 实 褐 旬 柒 及 烯 味 嫂 峦 臆 妮 要 答 奏 睹 桥 当 桃 了 宰 梆 问 褒 汽 县 渊 聘 芒 景 漫
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- 医学 课件 15 核酸 研究 方法
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