医学课件第二章基因工程的酶学基础.ppt
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1、第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶 李 罢 兜 下 汉 舀 盔 萄 斜 屿 皆 个 灵 巍 睬 桂 恢 咬 眺 樊 意 呆 阐 松 鹊 吐 间 膀 全 蹬 麻 获 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键,从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的 蛋白酶。 基本概念及其生物功能 特异水解断裂RNA分子,核糖核酸酶(RNase) 特异水解断
2、裂DNA分子,脱氧核糖核酸酶(DNase) 非专一性酶,底物或者为DNA或者为RNA 从核酸分子末端逐个降解核苷酸,叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫内 切核酸酶 按水解断裂核酸分子的方式: 根据作用的核酸底物不同: 保 享 草 萧 揍 蛰 晾 淹 晨 狂 鼠 耪 啤 纶 想 栓 栏 靴 恶 军 鲤 矩 温 粱 恨 划 咳 钒 枚 害 凡 吵 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 基因工程的操作,是在分子水平上的 操作,是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶 ,连接酶,DNA聚合酶等)作为工具对基因进 行人工切割
3、,拼接和扩增等操作。所以把这 些酶称之为“工具酶”。 工具酶 彬 共 渺 级 智 令 涅 铣 票 疆 糜 塔 册 霹 冉 隙 伪 碰 捣 贤 涧 俘 琢 收 力 芒 寅 搜 贩 挫 好 赊 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 第一节 限制性核酸内切酶 却 部 吏 部 掘 猩 俱 般 褒 脑 虚 快 茫 汪 叠 庚 烈 娟 焕 墩 庄 绳 倒 锻 骨 瞎 舀 疡 泄 涯 恫 改
4、第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp), 并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 限制性核酸内切酶概念 身 钻 降 泪 样 妻 磁 实 夜 射 耕 绰 搜 郑 藐 离 趾 娇 豪 耽 蔼 流 某 蜕 溶 孽 盼 多 溯 殿 耗 伐 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 2. 性质 内切酶 主要来源于原核生物 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5
5、-P和3-OH末端 自我保护作用 3. 功能 细菌的限制和修饰系统(R/M体系) 1. 来源 任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制 砰 损 笨 沼 弟 态 糯 严 弦 礼 恍 和 催 邵 肪 哇 阅 剧 敏 炕 他 熙 韦 断 修 辨 掷 韦 牡 湍 丝 巾 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 大肠杆菌B大肠杆菌K phage (B) EOP=10-4(限制作用) EOP=10-4(限制作用) EOP=1(修饰作用) 修饰的phage (K) 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象
6、简称(R/M体系)。 细菌的R/M体系类似 于免疫系统,能辨别自身的DNA与外来的DNA,并能使后者降解掉。 寄主的限制与修饰现象 E.O.P 成斑率 efficiency of plating EOP=1 萤 府 雪 遵 淡 毒 吐 台 沫 性 骸 手 壤 够 耽 锹 生 班 小 叔 虱 阮 端 集 霓 抑 撵 朋 凛 畔 雁 维 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分 解,切成小片断。 (1)限制(Restriction) 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA ,维护宿主遗传稳定的
7、保护机制。 祈 岁 饯 貉 漏 迎 里 腊 暴 舷 盯 杨 喇 共 卤 愈 课 毫 窝 刑 懒 瓷 郧 沦 姑 络 怨 忠 醉 境 效 被 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保 护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。 (2)修饰(Modification) Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase) GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基 修饰作用:宿主细胞
8、通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的。 给 枉 僻 垦 豢 愁 云 轧 受 知 铜 爆 沛 觉 第 世 豁 裹 试 卑 著 沦 翻 茸 漳 疟 殆 屁 咱 款 滔 距 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 淑 莫 辐 江 入 惦 嗜 张 店 珠 澄 该 函 播 荡 峦 旗 丈 刃 愧 逼 评 需 牢 恕 锁 刨 遣 暖 眩 壹 酌 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 (3)限制与修饰系统相关的三个基因 hsd R: 编码限制性内切酶 hsd M: 编码限制性
9、甲基化酶 hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 这类酶能识别DNA分子上的特定位点,并将双 链DNA切断 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化, 即起修饰 DNA的作用。 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。 竭 柜 醚 羡 均 锑 泽 葡 拓 井 囊 整 哥 铀 誓 佃 辣 篆 胖 桩 龚 瀑 喻 恨 锹 缓 责 禹 秃 舒 瓤 筑 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株,B株 中, 1)宿主细胞甲基化酶,将染色体DNA和噬菌体 DNA特异性保护. 2)封闭自身所产生的
10、核酸内切酶的识别位点- -(修饰) 1.大肠杆菌宿主细胞 K株,B 株 ,有各自的限制和 修饰系统。 限制和修饰作用的分子机制 消 哄 由 职 却 允 挚 郴 梅 医 丑 阎 疾 抗 愿 碰 粗 婿 视 伪 凯 抒 帐 仪 纺 耗 罗 憎 滇 菱 扁 郝 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 3. 外来DNA入侵时,遭到宿主限制性内切酶的特异降 解 -(限制) 4. 由于降解不完全,外来少数DNA分子在宿主细胞中 繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰,虽然是外 来却不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时,丧失了原宿主 菌修饰的标记,
11、丧失在原宿主细胞中的存活能力。 基因工程中,应采用缺少限制作用的菌株作为受体。 恕 狡 陌 腮 箩 扎 脯 沈 烬 灿 桩 了 属 淆 揣 碘 涌 兵 此 樱 慰 躁 望 獭 闭 兢 射 疽 乞 蛙 寇 哑 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 第一节 限制性核酸内切酶 诺 掺 炽 误 偿 线 罐 题 烽 赵 太 帛 中 痉 坦 涩 男 挂 宇 粤 形 兆 浙 祸 钉 邻 毯 松
12、 钓 肇 窖 讹 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 ,命名原则如下: 限制性内切酶的命名 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名,组成酶的基 本名称。 大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示; 流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示 擂 舵 啦 新 邑 投 段 父 固 赤 校 蓝 许 奎 涌 凹 吉 坊 庞 命 供 潍 潘 哼 酸 掘 料 迸 锅 再 酗 掠 第 二 章 基 因
13、工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中,则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后,若酶的编码基因 位于噬菌体(病毒)或质粒上,则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。 如 Hind :d菌株 EcoR I :抗药性R质粒 撬 鸳 鉴 题 撰 龄 壕 堂 配 捍 之 翌 搽 壁 若 杜 纱 脓 懦 捐 综 泳 本 带 拐 波 聘 剖 仟 紫 萤 畅 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统,用罗马字母表示该菌株中发
14、现某种酶的 先后次序。 如Hind :d菌株中发现的第二个酶 4. 所有的限制酶,除以上名称外还要冠以系统名称 。限制性内切酶的系统命名为R,甲基化酶为M。 如 R.Hind 表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M M. .HinHind d 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶 实际应用中,实际应用中,R R常被省略。常被省略。 枝 肠 宪 新 狙 菇 拐 舞 双 骏 雪 心 扫 率 凤 音 庆 峻 攻 蒂 豌 胎 惫 袱 挤 殃 蹋 候 广 楞 赌 队 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 EcoR I Escherichia 属名
15、Coli 种名 Ry13 株系编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和 第三个字母。 衫 褪 逢 袍 株 棘 鹃 久 由 代 专 吩 畔 窝 墒 谅 疟 泪 盆 言 痰 续 坍 锰 睛 唁 捍 胖 恫 遭 阿 紫 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 目前鉴定出四种不同类型的限制性内 切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割 特性、催化条件及是否具有修饰酶活性 ,可分为、型。 限制性内切酶的类型 禁 浅 具 熏 侵 龟 焊 雅 敖 吨 蠕 忱 绅 怕 旬 裴 附 氰 萍 斥 搞 滇 骤 减 揭 算 讶 咱 曳 埔 次 皇 第 二
16、章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 二、限制性内切酶的类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性,可分为、型。 主要特性型型型 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 双功能(具甲基化) 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割 单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割 双功能(具甲基化) 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割 基因工程中使用 注: SAM为S腺苷甲硫氨酸 闭 汽 狮 秀 竿 决 乔 矿
17、 跑 翱 骂 鸯 奎 涌 驼 奇 玲 善 咐 购 她 媚 猖 碧 亦 滋 满 状 嚏 柒 废 洲 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 (1)识别位点序列 EcoB: TGA(N)8TGCT EcoK:AAC(N)6GTGC 型限制性内切酶的基本特性 如 EcoB和 EcoK。 未甲基化修饰的特异序列。 N:表示任何一 种核苷酸 在 悯 锡 食 挎 忍 教 颓 丈 娄 迁 和 松 怂 卧 吵 帮 盟 漠 挑 瓣 虫 揭 痈 鞍 午 宾 稠 舰 房 坏
18、榴 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸) (3)辅助因子 在距离特异性识别位点约10001500 bp处随 机切开一条单链,不产生特异片断,应用不大 Recognize site cut 1-1.5kb (2)切割位点 嗜 滦 缀 噪 椭 搽 仔 蛋 粕 临 侠 丢 芜 澄 漳 顷 径 出 衬 哄 蝴 蓖 一 许 遥 悟 巷 部 毫 涂 啡 伊 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox
19、在1970年从流 感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind 未甲基化修饰饰的双链链DNA上的特殊靶序列(多数是回 文序列),与DNA的来源无关。 A B C C B A A B C C B A A B N B A A B N B A 或 型限制性内切酶的基本特性 (1)识别位点序列 坠 凌 练 巢 躲 筋 坚 和 鸦 撒 蠕 把 惰 慑 声 硼 瘁 米 靴 拒 肇 台 梅 白 澈 闽 轩 凸 瑚 揉 让 频 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端(sticky end) 或平齐末端(blu
20、nt end)。如: EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端 (2)切割位点 断 疼 粪 入 札 祝 镑 摈 桅 陕 萝 卑 侄 鉴 菱 敝 毕 轧 牌 壳 舍 组 肘 郝 俞 赵 统 鸵 略 墅 库 降 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 A A G C T T T T C G A A A A G C T T T T C G A A ABCD DNA DNA Hind Hin
21、d切割位点 核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用 智 孜 挨 柯 识 剃 啥 父 柞 遍 挝 佯 纹 琵 蜕 柄 疥 艺 替 攫 恢 倚 名 拥 饺 浊 勺 镣 漂 钨 们 煞 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 在完全肯定的位点切割DNA(识别识别 位点下游24-26bp), 但不是对对称的回文顺顺序,且在识别识别 序列旁边边一定数目核 苷酸的位置切割。 反应应需要ATP、 Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。 型限制性内切酶的基本特性 风
22、榴 据 欧 浅 貌 攘 倦 木 删 纶 艰 侥 滓 足 倔 哲 煎 模 雁 益 阉 垂 业 消 潮 暇 献 玲 宁 绳 厚 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 IV型限制性内切酶 新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已 被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的 DNA序列。 除EcoKMcrBC外,识别序列尚未确定, 目前尚无应用。 沿 裹 避 何 馒 零 橡 狮 年 微 时 篡 彦 伙 鸟 搀 谬 刃 磅 矾 粟 恬 莹 匈 笆 抿 狗 愤 蜜 导 绞 舟 第 二 章 基 因 工 程 的 酶 学 基 础 第 二 章 基 因 工 程 的 酶
23、学 基 础 核酸限制性内切酶的类型及主要特性 特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶 内切酶的 蛋白结构 3种不同的亚亚基单一成分2种不同的 亚亚基 限制作用 所需要的 辅助因子 ATP、 Mg2+和 SAM Mg2+ ATP、 Mg2+ 和SAM 寄主特异 性位点识 别序列 EcoB: TGA(N)8TGCT EcoK: AAC(N)6GTGC 回文序列, 旋转对称 (IIs型除外 ) EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 抑 闺 汞 糙 琴 讥 赂 伍 蔗 效 境 筛 销 捌 熙 懈 嫂 准 选 掘 矿 慧 辕 贩 衣 具 肾 亨 渣 盎 颠 砚 第 二 章 基 因 工
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- 医学 课件 第二 基因工程 基础
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