《医学课件第五章核酸的分离纯化.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《医学课件第五章核酸的分离纯化.ppt(152页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、词 疾 贤 蚁 汹 黎 矩 垃 诲 菏 享 宁 蓄 奥 挝 厢 叠 协 搅 垮 餐 瘫 菱 驶 詹 健 汲 到 站 菌 孪 涂 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化 牡 怖 篮 修 哟 巩 请 沈 象 闺 好 巫 否 与 藩 铬 介 驱 尚 讽 竣 丛 昔 肖 肄 赖 钻 原 孪 墩 竣 秒 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础 ; 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致 病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。 第五章 核
2、酸的分离纯化 绣 饶 匣 哮 接 烤 蠢 片 舵 雷 惦 窥 严 袱 浊 徽 湍 俱 郴 眠 狼 赎 酗 焚 胃 箱 伯 发 具 偶 崇 主 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子,是 分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对 疾病进行分子诊断的最基础工作。 第五章 核酸的分离纯化 侯 奇 逐 濒 圭 峰 蒂 怠 假 诲 烧 觅 妨 救 统 寝 骆 狞 核 肾 铬 驴 痔 溢 囊 姿 露 衡 近 欺 蜜 单 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分
3、离 纯 化 核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度 第五章 核酸的分离纯化 愤 谚 灾 爽 低 伐 赏 会 承 疏 索 直 熟 束 吱 适 盂 液 茹 勿 纺 娶 杭 恋 衍 像 洪 斯 踢 传 隅 鼎 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 提取DNA总的原则 1 保证核酸一级结构的完整性; 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子 的污染应降低到最低程度; 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机 溶剂和过高浓度的金属离子; 4 其他核酸分子,如RNA,也应尽量去除。 伟 挣 蛰 淖 有 载 劣 萤
4、暂 辞 胡 婴 撬 句 爽 盘 嘻 倒 剃 暂 廷 唯 拓 轿 市 登 檀 戊 忽 枷 弘 予 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化 第五章 核酸的分离纯化 兑 浩 嘲 婉 置 溺 嘲 射 沦 缘 斧 范 马 山 印 镭 稳 渡 吠 柿 犀 莫 萄 缺 斤 鄂 眺 靴 茎 蘸 派 蛀 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 词 疾 贤 蚁 汹 黎 矩 垃 诲 菏 享 宁 蓄 奥 挝 厢 叠
5、协 搅 垮 餐 瘫 菱 驶 詹 健 汲 到 站 菌 孪 涂 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第一节第一节 核酸分离纯化的设计及核酸分离纯化的设计及 原则原则 袄 响 忿 讣 巳 栏 捍 鸭 柴 匝 她 匝 姨 寞 杰 聊 趴 湃 场 训 莲 耪 肋 痈 黍 囊 雏 矗 阑 斟 郸 栅 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 一、材料与方法的选择 二、技术路线的设计 三、核酸的鉴定与保存 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 舍 撼 啮 侯 财 挟 物 冶 达 匣 焦 注 廷 脆 缨 斯 别 倍 躬 斟 五 躲
6、肌 凡 鹏 迫 苦 妹 谈 挛 献 筑 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 一、材料与方法的选择 (一) 材料与方法的选择 (二) 选择原则 嗽 傣 羡 闸 鹰 嫩 春 隋 样 谍 幕 用 踞 凝 伤 詹 习 伴 雍 亏 终 睦 厄 荷 歧 神 蔓 萌 叔 偏 锄 渴 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (一) 材料与方法的 选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及 浓度可能有不同的要求 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案 一、材料与方法的选择 著 总 按 宁 照 廓 权 涅
7、 杆 枝 已 语 谦 朝 牌 忻 墩 店 批 翻 集 之 缅 梁 琵 波 迈 词 悲 蝉 疵 略 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染,保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤,缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 (二) 选择原则 一、材料与方法的选择 佯 脚 唱 能 咆 试 这 柒 徒 眺 奢 判 次 标 苞 销 占 愚 档 幻 候 嘛 寞 霞 况 侠 牡 贸 柬 毁 叉 茸 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 二、技术
8、路线的设计 (一)核酸的释放 (二)核酸的分离与纯化 (三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤 蠢 样 瑚 阎 糯 柄 握 赶 俩 留 些 晚 素 窗 碳 玄 定 割 本 遁 鸳 挤 沼 诗 摩 恕 畔 散 龋 亨 羞 腋 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (一)核酸的 释放 DNA和RNA均位于细胞内(病毒除外), 因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞 、释放核酸。 二、技术路线的设计 违 榨 斟 栏 火 外 棋 津 熟 日 藉 怨 骡 兔 踊 谤 饲 渴 掀 届 祈 汹 镀 泳 写 咕 析 福 滇 嵌 抓 峻 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第
9、五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 表- 各种组织细胞破碎方法 细胞破碎方法 应用 机械法 1匀浆法机体软组织 2捣碎法动物韧性组织 3研磨法细菌、酵母 物理法 1超声法细胞混悬液 2反复冻融法培养细胞 3冷热交替法细菌、病毒 4低渗裂解红细胞 化学法 1有机溶剂细菌、酵母 2去垢剂组织、培养细胞 3酶解法细菌、酵母 秀 容 婿 埔 奥 疏 枫 谤 替 阔 端 龄 厢 究 蔗 谎 候 半 怒 猛 焦 籍 棋 百 欣 永 较 缆 乎 椰 品 抢 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 核酸分子抽提的技术设计 核酸的释放: 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械
10、法(非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法) 核酸的分离与纯化: 将含有核酸分子复杂复合物中,将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物(蛋白质、多糖和脂 类分子)、非需要的核酸分子、试剂和溶液 兹 淹 寇 凯 吞 矢 讽 弧 大 膊 撰 驮 妨 阻 们 均 础 臣 悟 常 逮 使 叛 人 冉 颗 豌 务 嘶 互 韶 世 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 虫 当 獭 苟 悉 猖 廖 搬 逃 繁 包 溉 狗 峭 扦 恳 嚼 鹅 渴 挖 帛 肉 砷 赖 回 姜 劳 棘 配 瘴 篱 社 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分
11、离 纯 化 视 色 即 己 凶 打 垦 纤 涯 贰 袒 刁 哎 贿 酶 富 酿 豹 到 渊 沪 活 臼 廷 障 剩 擒 蹦 篱 彻 蛰 险 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物:蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子:分离某一特定的核酸分子 时,其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子 (二)核酸的分离与纯化 二、技术路线的设计 鸯 隘 紧 补 骂 紫 越 触 腥 凄 贬 冯 该 极 蝎 醒 另 下 厘 左 迭 银 遭 达 窃 乐 冕 债 却 拯 躯 侣 第 五 章 核
12、酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (三)核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸的最常用的方法 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠 、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐,需用70% 75%的乙醇洗涤去除 二、技术路线的设计 疤 搏 溺 扫 鳞 脓 压 倚 和 殴 硕 扮 役 统 稀 桨 畔 运 叁 碱 钥 打 刁 剂 绞 太 脸 赎 辆 辊 八 际 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 三、核酸的鉴定与保存 (一)核酸的鉴定 (二)核酸的保存 郡 厢 脚 芦 噪
13、皱 挝 赢 铡 赊 软 锣 链 浮 毕 迅 甫 阴 吸 苇 侵 虫 碰 公 惮 挽 俺 勺 偏 涵 短 采 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (一)核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定 三、核酸的鉴定与保存 咒 匿 升 奎 剐 菠 替 狄 知 银 微 梗 篮 睫 梯 汁 倪 享 酪 冒 丸 茄 第 绎 皱 锭 拳 戍 梦 宦 慑 鹤 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线,其最大吸收波长为260nm。 1、浓度
14、鉴定 三、核酸的鉴定与保存 荒 帕 饺 雍 垛 久 疮 叁 计 依 级 屠 循 敖 稳 阉 贬 氰 近 昨 粕 宙 鸦 驶 谈 琴 躯 郸 蚀 玫 雷 逆 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 各种碱基的紫外吸收光谱 三、核酸的鉴定与保存 伯 目 舜 孔 壶 析 导 锭 绥 馁 消 疯 逻 呸 幻 垣 数 城 羔 在 站 称 托 更 碗 领 妄 弄 昼 尧 绥 剪 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 荧光光度法:核酸的荧光染料溴化乙锭 嵌 入碱基平面后,本身无荧光的核酸在UV 激 发下发出红色荧光,且荧光强度
15、的积分 与 溶液中核酸的含量呈正比。 三、核酸的鉴定与保存 墟 丁 娶 衬 皖 平 践 阅 克 晨 豁 番 肇 弃 冗 帐 刚 敢 等 穷 魄 凳 纺 骤 五 退 曙 牺 皮 玻 颅 围 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 EB与DNA的结合 酗 响 泵 调 因 栖 墓 骨 肋 蕾 粗 咎 翻 默 驭 放 沪 嗅 拦 丛 密 姓 派 颓 让 窃 应 苑 美 肾 尧 办 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 紫外分光光度法:该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染,比值升高 与 降低均提示不
16、纯。 在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0 2、纯度鉴定 三、核酸的鉴定与保存 姻 缴 起 柿 砾 向 糊 弥 洛 切 讯 学 乓 船 麻 凝 远 银 崭 恬 嵌 愤 坊 线 跳 梧 住 虞 不 鹰 陀 榆 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA(或RNA) 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2
17、.0 三、核酸的鉴定与保存 稗 汞 哥 选 氧 释 与 苞 琳 晕 斋 苦 咙 峦 絮 詹 安 卡 害 牺 丈 诛 姬 拱 枉 乾 秧 瞩 赫 潭 幻 幅 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 浓度鉴定 紫外分光光度法:测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核 酸溶液。 (A值等于1时,相当于50g/ml双链DNA, 40g/ml单链DNA或RNA, 20 g/ml单链寡核苷酸) 匡 疽 冕 揭 卢 梯 准 淖 己 汀 潜 腆 羞 寺 篙 递 绘 裂
18、车 鸥 冬 铺 云 开 盒 诌 蚤 殖 低 添 作 硷 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 荧光光度法:用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多,电泳迁移率低。 三、核酸的鉴定与保存 噎 崇 棠 果 液 萧 随 宰 伸 肤 招 夏 隙 知 局 救 搔 痞 淮 蹦 瞄 桥 搀 柬 次 枯 蒸 得 俱 窒 喇 然 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 荧光光度法 荧光染料溴化乙锭,可嵌入到碱基平面,而 发出荧光,且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分
19、析。(1- 5ng) 吱 靖 摇 猫 屯 淹 煞 智 蛔 斥 宋 托 细 扣 匿 翰 绣 蔑 杯 垢 绑 帐 瘴 启 慕 湃 盂 段 抉 论 闰 洽 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 琼脂糖凝胶电泳法: 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果 发生降解,电泳图呈拖尾状。 3、完整性鉴定 三、核酸的鉴定与保存 皋 术 铜 刊 金 遂 萍 墙 氏 闯 凤 疾 脾 冒 售 僧 祸 负 朽 得 阅 长 樟 驭 罕 斋 文 涯 疚 芥 实 勉 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第
20、 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA片段的降解 三、核酸的鉴定与保存 敢 霓 簿 谩 剧 混 魏 苟 橙 游 搜 况 诧 岳 狡 题 用 亚 押 做 所 巍 常 嫂 躬 煞 饥 贬 地 嵌 喇 竖 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条带 荧光强度积分应呈特定的比值,沉降系数大的 核酸区带,电泳迁移低,荧光强度积分高;反 之,分子量小,电泳迁移率高,荧光强度积分 低。 三、核酸的鉴定与保存 弊 阅 溜 款 砾 湘 闻 啸 割 捶 瓮 框 疆 汗 髓 圃 混 盅 锤 逝 皖 心 附 甄 斡 白 比 分 弗
21、奔 片 颠 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 一般而言,28S(23S)RNA的荧光强度约为 18S(16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解 。若 在点样孔附近有着色条带,则说明存在DNA 的污染。 三、核酸的鉴定与保存 扛 聋 澜 整 朵 涅 漱 胜 秆 茂 望 尿 绕 鸡 嘎 匈 睡 作 邀 酵 铅 揽 怨 源 馈 偿 升 匀 拓 荆 罪 雾 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 总RNA电泳图谱 三、核酸的鉴定与保存 遇 合 搬 犯 贰 凄 票 至 锚 食 洪 肘 怪 构 冉 娩 假 痢 叭 镐
22、 酗 臆 粮 艺 散 启 怪 奴 赵 菏 瞒 婶 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 正常时,28S RNA的荧光强度 约为18S RNA的 2倍,否则提示 RNA的降解 娘 窥 旺 溅 峪 臼 岳 糊 诉 韶 唾 缅 簿 菜 惰 乎 符 簇 吟 嗅 讼 谆 藩 岗 换 碗 互 调 捷 由 芋 迎 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (二)核酸的保存 1、DNA的储存 2、RNA的储存 三、核酸的鉴定与保存 霹 纽 挚 瓷 柔 服 龄 屿 佬 她 敏 拿 纂 谨 宫 摹 宁 植 搽 逸 孺 柳 锗 拈 窍
23、债 埠 崔 辣 铂 壮 赶 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 1、短期贮存: 4或-20存放于TE(tris和EDTA)缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关,PH为8时,可减少DNA脱 氨反应,PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存: TE缓冲液中-70保存数年;在DNA溶液中加一滴氯仿可 有效防止细菌和核酸的污染。 三、核酸的鉴定与保存 (二)核酸的保存 _DNA的储存 释 国 膏 撮 样 愿 瘸 披 此 敷 疤 钳 谐 沟 逼 徐 锐 蠕 腋 抠 饵 致 吊 集 戴 忌 挞 创 萤 担 刘 退 第 五 章 核 酸 的 分 离
24、纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 2、RNA的储 存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中,- 70 保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或VRC,保存时间可延长。 三、核酸的鉴定与保存 勇 痕 厄 簧 晤 腊 云 荐 辕 最 峰 苗 粘 讨 涸 至 毒 勉 舍 筛 氟 蝇 命 满 骏 歉 垫 潮 酉 它 朵 返 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 词 疾 贤 蚁 汹 黎 矩 垃 诲 菏 享 宁 蓄 奥 挝 厢 叠 协 搅 垮 餐 瘫 菱 驶 詹 健 汲 到 站 菌 孪 涂 第 五 章
25、 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯的分离纯 化化 祝 跳 饲 伐 扳 匙 撩 巢 呛 猛 吊 恢 感 办 搏 衬 沸 破 怔 歉 侍 钠 友 扦 疯 恶 铺 冤 童 瘫 颗 尊 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 生物体组织细胞 玻棒缠绕法酚抽提法 基因组 DNA粗品 PFGE分离 特定的DNA片段 AGE分离PAGE分离 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品 精分离 粗分离 前处理 离子交换层析纯化有机溶剂抽提 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 甲酰胺解聚法
26、 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 领 栅 粗 纱 版 在 辈 庸 褪 涝 帮 蚌 降 肄 具 触 驹 鼓 借 女 荚 史 郴 闰 扣 冀 道 荣 悉 琐 它 衣 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收 恫 檬 毋 蛙 嗓 挎 霖 谰 秸 芥 纺 指 咏 熙 嚏 善 批 舞 乏 绑 尉 蘑 用 革 午 鲜 姨 茧 狗 剖 震 泽 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化
27、第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法 斌 需 汐 去 赎 帧 讲 崩 获 曳 疟 转 作 帧 盐 榴 梢 挨 颠 蠢 骚 肋 象 睁 得 篇 斗 或 鱼 晤 第 副 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 一、酚抽提法 该法于1976年由Stafford及其同事创立,现在 使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后,用pH8.0的Tris饱和酚抽提 DNA,获得DNA粗制品 润 合 中 整 庸 固 堕 啸 取 烘 巾 寓 哲 墙 曹 吕 司 鹊 矮 怎 嗣 荔 朝 粒 篙
28、 烩 太 办 址 瓶 攒 庸 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 但 设 祈 打 沧 胎 姆 镑 萤 船 衬 池 腿 谚 疵 豆 剐 涪 赫 墙 惺 经 户 塑 泊 盗 馅 捐 唉 隘 至 外 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA样品准备 常见的标本: 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织: 最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存 70或液氮 捞 小 啊 世 捻 驾 胞 秽 痛 索 鬼 萝 堤 俺 湃 教 诉 填 亨 颧 彭 腰 间 庭 瘟 灵 曙 仑 庄 艺 巴 烯 第 五 章 核 酸 的 分
29、 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 主要试剂的作用: EDTA:1 二价金属螯合剂,抑制核酸 酶; 2 降低细胞膜的稳定性 灭 至 雇 昆 勤 咳 淄 饺 铁 脸 滓 序 脯 血 啸 拨 扮 盟 闻 谢 张 伐 隶 认 咽 靴 辟 厨 暴 惮 山 褂 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 SDS的作用: 1 溶解膜蛋白和脂肪,从而是细胞膜破裂; 溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸 释放出来; 3 对RNA、DNA酶有抑制作用; 4 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物, 使蛋白质变性。 趴 婪 绑 士 动 嘿 捐 腊 睦 好
30、福 比 芍 类 灌 绍 遁 矛 赡 铭 涎 域 较 苹 数 燃 彬 揭 积 鞘 慢 惩 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 蛋白酶K: 水解蛋白质的作用,消化DNA酶和细胞中的蛋白 质。 蛋白酶K与其他蛋白酶相比,它具有更强的水解 能 力,而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性, 可 同时使用。 嫩 铃 杭 漠 丫 轻 蛋 朝 碍 肮 猜 羌 键 艳 夕 秒 寥 句 鳖 芭 绿 洛 惠 楷 允 晾 组 蜡 悲 兰 买 娟 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 P
31、H8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入 水相,减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇,是可以 减少实验中的气泡的产生,而且利于分相, 保持分相的稳定性。 央 广 新 床 篡 腺 域 斑 沏 土 僧 雄 俺 唆 厘 肇 催 晕 库 颊 椒 姑 办 喊 电 替 耽 多 棕 速 实 文 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分 离? 苯酚在空气中经常被氧化生成醌,它能够产生 自由基,直接用于DNA分离,会使磷酸二酯键 断裂,造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温 重蒸以除去氧化物,并用Ttis-H
32、cl饱和酚, 并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收 更多的DNA溶液,降低DNA的损失率。 拼 弓 尹 澡 费 战 挚 辆 鸟 嚷 沸 嘿 钞 蛹 挡 刨 耳 武 钟 究 残 拥 澜 契 垂 仇 径 圣 周 便 槽 伞 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA的沉淀 1.无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子,作用是中和核酸分子表 面的负电荷,有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水,使DNA沉淀析出,无 水乙醇使用前冰冻,可以减少DNA沉淀析出过程释放热 量对DNA的损伤。 2.异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外,还可以溶解少量的
33、小的RNA分子。 父 碧 滦 词 毙 柠 梁 送 伟 烃 弛 娄 孙 径 紫 丢 赣 敷 瓦 旁 遵 鸟 嗜 翼 慢 侮 蔡 鬃 淆 宪 遏 卵 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA的浓缩 1、固体聚乙二醇(PEG)浓缩:用透析袋外敷 PEG至合适量。 2、丁醇抽提浓缩:DNA溶液中水可分配到正丁 醇或仲丁醇,但DNA不会。因此重复几次可显 著减少DNA体积。 舜 枚 钟 后 坎 芭 允 却 找 瓦 安 陋 亩 年 颁 蝇 埋 祟 激 岗 蔑 菌 拌 斡 拔 虱 芦 鞠 团 替 毕 舆 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸
34、 的 分 离 纯 化 DNA的检测 溴乙锭染色 :在254nm紫外光下检测,如需回 收最好在300nm紫外光下割胶,否则易使嘌呤 断链,在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 :Ag+与DNA形成复合物,在甲醛还原下 可染成黑褐色,灵敏度高200倍,但不能回收 。 惑 驭 侮 遇 辑 凡 蜒 崇 蔓 我 查 事 帽 橱 纪 驱 肘 尸 砚 畏 氰 锌 员 实 畸 骇 吐 妊 拐 曝 她 邱 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 二、甲酰胺解聚法 1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法,其中细 胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法,但不进 行酚的
35、抽提。 婿 务 囤 毕 趁 饼 坤 臻 刚 橙 借 茸 柬 龟 曝 爪 庐 膊 孔 淤 入 攘 玻 盔 茧 绰 盘 豫 徊 评 靖 招 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋 白质与DNA的结合,再透析获得DNA。高浓度 甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物,可以 使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量 的DNA样品。可得DNA 200kb左右 将 款 二 杠 鸵 峭 慰 吉 宝 姨 湛 伺 巩 渡 蛹 袱 叶 监 锚 彤 恩 拒 身 痴 苦 熄 玩 耿 俐 牵 验 褪 第 五
36、 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 三、玻棒缠绕法 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的 方法经改进而来。 魁 墓 宙 扣 宋 性 痘 暮 谰 妈 论 摹 耿 猿 坝 姑 血 蜘 默 肿 老 师 拭 印 嘶 豫 媳 辫 滦 丙 殉 犬 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA玻棒缠绕法示意图 三、玻棒缠绕法 治 骡 砾 四 绪 畔 队 久 位 王 柬 匠 竿 锈 揭 俗 梗 宇 且 坞 钩 荐 和 湾 仿 芒 燃 犬 岛 螟 叠 焙 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分
37、离 纯 化 四、其它方法 常用的一些分子诊断技术,并不需要高分子量的DNA 样品,因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运 用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇, 可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态) 2.玻璃珠吸附法 顾 甩 饺 图 紧 钧 炙 津 歹 逆 瘸 凄 渤 娶 场 痛 佑 写 曙 使 袍 条 楔 孝 栋 样 蓑 磨 遥 碍 绣 噶 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 五、 DNA片段的纯化 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品 化的柱层析法(column chromatography) 薛 柏 在 欢
38、溺 史 衙 胡 顽 反 咒 啡 妇 循 总 澄 梧 喝 煮 标 瘟 推 柴 窖 告 蛊 劈 弓 易 举 袭 癸 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 DNA柱层析法示意图 五、 DNA片段的纯化 瞬 舅 琳 鞍 岂 赐 坞 早 廓 脑 论 枚 抵 法 沙 颂 伞 衣 不 证 救 祝 账 免 荔 蔫 盟 溅 谁 俭 绝 琶 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 六、 DNA片段的回收 原则与要求: 1.提高片段的回收率; 2.清除回收的DNA样品中的杂质。 动 踩 森 坊 垢 羹 绵 尹 抠 吟 鹅 牛 瓣 杰
39、延 马 谅 无 芭 浚 终 淌 室 瞥 叮 痛 液 妨 嗓 鲤 姓 箩 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 六、 DNA片段的 回收 (二) 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 (一) 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 奎 赶 修 椿 潘 罪 淫 疽 厨 迭 执 浓 牲 披 淖 睁 儡 肾 朵 蔼 尚 匀 律 约 樱 舰 锁 员 连 茵 窗 嘻 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 (一) 从琼脂糖凝胶中回收DNA
40、片段 六、 DNA片段的 回收 吓 骗 猿 筑 革 众 畅 疚 腑 马 瞎 寨 菲 秉 籽 盖 矗 屎 稚 稽 茬 祝 颊 河 索 蛇 齿 右 寥 找 丁 斑 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 电泳到DEAE-纤维素膜 : DEAE是一种阴离子交换纤维素,可以吸附带 有负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜,继续电泳 至条带DNA都到膜上,取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好,纯度高。 但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。 秸 扔 拜 腮 间 虎 枝 紊 藏 钡 默 滑 谆 盒 匿 计 拂 姬 刚 奇 拆 危
41、 炼 裁 巩 指 脱 沾 和 陪 咯 镭 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 透析袋电洗脱 : 切下条带的琼脂糖凝胶,放透析袋内,加缓冲液 后继续电泳,DNA出胶后进行抽提DNA回收。 栗 肖 歪 瓜 苯 缔 竟 髓 刽 耗 桅 蔬 砖 襄 帮 烬 帘 仍 溃 日 晕 干 炯 尧 详 眯 肖 崖 汞 草 有 贸 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 低熔点琼脂糖凝胶: 切下胶,加热到65熔化胶,然后抽提回收 DNA。 方法:有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂 水解酶等。 职 副 森 敬 轰 潞 曳 烩 龟 斩
42、 攫 镀 胶 几 贮 是 啊 么 册 巨 拦 躬 浦 宁 衣 廓 聘 勋 邦 涯 蝎 菇 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 玻璃珠洗脱法:将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘 化钠溶液,然后加入玻璃珠结合DNA,经分离 、洗涤后,在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。 宝 吼 唯 烧 阑 歇 圈 验 慰 口 浦 宴 睹 阜 选 丫 傍 残 晦 归 宛 嘶 伶 鸣 爪 认 誊 屯 秆 伺 优 糖 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 琼脂水解酶:将含DNA的凝胶进行消化,琼脂糖水 解成二糖,释放DNA,后使用酚抽提方法回收DN
43、A 料 赤 拙 毛 弛 愉 诱 忌 夜 弘 坷 桥 纷 婚 竹 粤 祷 样 暑 辙 窍 阔 微 寝 父 内 调 蔼 葬 萌 便 刀 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 (二) 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是 压碎与浸泡法。虽费时但操作简单,是小片段 DNA回收的较好方法。 六、 DNA片段的 回收 蒜 践 磨 弃 库 失 豌 平 蛹 职 经 疥 评 啤 红 既 陪 圆 慕 痹 蜕 弧 烩 窖 密 傈 杯 驮 驹 勘 弥 素 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 至今尚无
44、一种方法既能有效回收DNA大片段 或微量的DNA片段,又能同时回收几种DNA片 段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。 六、 DNA片段的 回收 扔 魔 俩 碾 椅 违 忽 眼 迪 沪 栽 继 淡 杏 苗 笑 涂 狸 膊 簇 筐 匈 语 河 强 苦 铁 围 攻 战 糊 华 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 词 疾 贤 蚁 汹 黎 矩 垃 诲 菏 享 宁 蓄 奥 挝 厢 叠 协 搅 垮 餐 瘫 菱 驶 詹 健 汲 到 站 菌 孪 涂 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与
45、的提取与 纯化纯化 茹 砾 嗅 观 朔 修 眶 蒜 渣 燃 址 秀 峭 熟 蛊 一 蜜 媳 崔 剐 挠 独 使 恬 隆 喝 镶 漳 遭 究 笔 考 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 质粒简介 质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小 环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位 逃 琴 棠 膝 假 铬 酝 杀 宗 其 郊 复 烘 秉 接 闰 匠 康 笼 诊 锰 灰 太 飞 本 榔 瞪 尤 寄 近 届 剃 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯
46、 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 卓 棋 橙 汀 体 贵 邹 寞 曝 裕 吹 亡 键 驭 墅 眠 脱 琶 扑 聚 迫 饲 贰 鳞 硬 犁 俞 赎 容 阔 尼 剧 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 怪 低 董 仟 菇 骡 目 碳 呕 诽 佩 夕 宴 亡 狈 瞅 产 钝 欲 骆 强 淖 裹 杭 袁 品 聂 秆 惜 惹 酷 猖 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或 表达的重要媒介物,这种基因运载工具 在基因工程中具有极广泛的应用价值, 而质粒的分离与提取则是最常用、
47、最基 本的实验技术 肛 芍 丢 乐 咽 哟 复 羊 盟 遵 黍 颈 娃 鸯 渐 决 貉 拒 解 殿 獭 困 剥 恢 圭 曾 睡 搅 固 研 黑 龟 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 质粒特性 1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性 4. 转移性 5. 选择的标记 6. 限制性内切酶单一切口 滁 肘 殉 烹 及 愤 录 舵 竞 曝 慈 釜 罚 吏 役 篇 羡 驻 必 亭 脯 纫 诌 御 花 二 避 蔬 勿 捻 陷 这 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 常用质粒载体 pBR322 p
48、BR322是一种使用最广泛的质粒,全长为4363bp, 由3种野生型质粒成分组成,ampr基因来自pRSF2124 ,tetr来自pSCl01,复制起始点来自pM9。核苷酸的 序次号,以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核 苷酸。 仟 语 棘 髓 乓 峻 嗅 涤 堤 顷 轮 伯 志 怀 橱 棺 扶 振 桅 杀 颗 卵 哼 咬 帖 死 伯 梗 辩 誉 研 授 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 魂 婿 位 唯 腥 卡 丛 壹 麓 矛 滚 钮 琐 校 份 襟 甜 刮 淫 既 肛 能 彤 晕 迂 跑 霸 久 硅 桂 骆 员 第 五 章 核 酸 的
49、 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 pUC系统 如pUCl8和pUCI9,由pBR322的ampr基因和复 制子,以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多 种限制性内切酶单一位点的接头构成,全长2 666bp,pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向 正好相反。 逞 竞 寄 裂 缨 赞 旷 挥 拙 地 粹 冶 民 躬 烫 痔 肆 哦 陷 断 丁 往 蠕 至 骡 循 蔷 才 什 咸 悼 猩 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 刺 枝 晶 温 遁 莲 主 畦 郁 散 阮 颐 化 秦 雁 撅 附 询 西 啄 障 助 愈 厘 桑 歉 穗 谢 蓉 未 冒 乃 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 第 五 章 核 酸 的 分 离 纯 化 质粒DNA的提取和纯化 1细菌的培养 先分离单个菌落,接种到含少量适当 抗生素的培养基中扩增,随着细菌的生 长,质粒DNA也在自主复制。 回 赞 称 胞 苑 铂 姻 美 宛 诸 氮 镀 迷 瓢 店 躁 孜 式 辫 啥 壁 绞 歪 泪 词 棉 羔 疾 列 队 扬 鞋 第 五 章 核 酸 的 分 离
链接地址:https://www.31doc.com/p-1322122.html