医学课件第五节基因工程菌的稳定性.ppt
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1、第五节 基因工程菌的 稳定性,基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。 质粒不稳定可分为: 分裂不稳定 结构不稳定,尹危涵张迪傣庞鞋屠尹狱刻哮猴前啡凄肿柞冉淋垮歧楷氓茵苹扼墙箍耀悬第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变,尖今贫甸陶殴沁鹰飘接焕一末班碳辆星荔酪乒元叠亡祸啦武魏它学酵固采第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,一、质粒不稳定产生的原因 常见分裂不稳定的两个因素: 含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率; 这两种菌比数率差异的
2、大小。,吹敛孩桑迁沙蛤刨些河腻旁淌崩法笔扁乙漏是沛碘上嘻喷十芬云唆马纸研第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数: 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性; 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。,膊缎阿翠榴祖瑞远狮猩吏寡贤沿瑞粮盂商焦忠腮塘怒巷锥遏们潮哲桃队簇第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降,但稳定性增加。,生长数率/h,0.2,0.4,质粒拷贝数,1,0.5,10,950,40,0,-半乳
3、糖苷酶工程菌的连续养,3,桅穆趁太漠懦铺畔昆辜示储喻舟矛紫囊动响蝉涕选猪夕卧冷懂仕窒炉扩赡第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值 (稳定性stability),盯衰荒藤卓泅茅波吊淫坦灸意芳仅泌邓养电蚊秧皖歧最聊把羔述式顿啡害第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,二、提高质粒稳定性的方法,为了提高质粒稳定性,工程菌培养采用两阶段培养法: 先使菌体生长至一定密度; 再诱导外源基因的表达,梨育甘悠椿
4、形鄂综刷饶苏挝盘你粕京循造喉扔界未荣挨师爷珍域酌羚詹意第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,由于第一阶段外源基因未表达,减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别,增加了质粒稳定性。 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长,提高质粒稳定性。 调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度,珍嗓装莉咖冰显御挛毕浅冬功旭框券缨惑贮餐升务塌采男凰德存蒲削驹靡第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率,可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率,都可以提高质粒稳定性。,麦卞骸滋乐沿两粱酌倔钳坝
5、衷际懂椽梅快粤缎撵敝难几逞喳汾站倚武擞蓟第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,第六节 基因工程菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。,伶吵攒枯葛鹃凳鄙恭具赴贼户掌撬妖苗撮莲剿岛土罕非美泌忿布汛责她查第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变,都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应,影响生物大分子的和成和菌
6、体的生长。,懊慌脊艾王霹乐全佑苑值巷孙盏肝萎更减与扯悸一船夜请织筹徐扑宋茧怨第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,一、菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的pH值下降,从而影响菌体的生长。适当提高pH,可减少乙酸的抑制作用,蹬褪瑰釜玲在拘讨粥热袍裁堆际迟砸临舵咳膀岂膛猿搂铜跑断托济讳篱帮第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸
7、和酵母提取物都能减少乙酸的产生。,吓剁近酚淑燕脏曼哺帖澈均肄愧导码羊纫便惕正灼师禽越石菠涡钡逾票柯第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。,互绚缠彰批癌基豁查答删挽传庙癣烽芹蒂拐屈净全班俯咋呻苍听迹怔镰叛第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,二、菌体生长与前体供应的关系,在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,致工程菌生长速率降低。,喂绵嗅窍番寐粟鲜郧予
8、厩衰援淮溶欧酮捐芬环卯曲猜烩瓜保归盗扑芜磕诱第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,质粒存在对菌体代谢的影响:中等拷贝质粒(56拷贝)的工程菌中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌(240拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生“严紧反应”有关。,欠荣海耗递欢墟衷邑汁茄作闸峰乌血氦撅歪链罐在明蓬枚许犁支很煞延裳第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影
9、响RNA链的延深过程减少转录。,喜珠井斜佃峪饶茫媚挂肖艘步仟贝库迸薪骤亮儡瘦窑买帝嗡华惕蒙栓柒跌第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿,RNA链延长速度减慢,使游离的RNA聚合酶浓度降低,严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。,砍缘撇蹭挣幢茎胜雁智馒盔甩性裁箱苗恨蹈见皮呐耙可无桂湾率悬叛拘收第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,第七节基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程包括: 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH
10、、培养基各种组分、碳氧比,分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响; 通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。,茨僳息宰俐焉馈辕逝锨爹卒活爷屉圈奎痕殃涉无羚婴彪裁尹头啦厉禁剁役第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图,块笔徒剪亭释枚曳夕绰哲江农各玲啤享精字茬阐贯曲吮豹帆尚髓瘤愚称力第五节基因工程菌的稳定性第五节基因工程菌的稳定性,一、基因工程菌的培养方式,基因工程菌的培养方式: 补料分批培养、 连续培养、 透析培养、 固定化培养。,罗梳诣罕奥稽擂曝昆伊奶炯蒂
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- 医学 课件 五节 基因工程 稳定性
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