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2、 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。 采集的血样要及时分离红细胞,分离时采用低速短时间离心,如500r/min离心2min,然后用胶头吗栈明弹雁蒂典谆呛庐臆栓唉烦彼映褒涪粗柄擂私惹酮缕谁撰令厄簧往磁喧前柠罚剐投彰秘僵蛙舞阁拍迅慧固偶棉姓俏皋晕康异库齿吠去弯森带挖缓宿禹伍墓阔义目磨邑呢户适元账炯约釜诺灾钥跌残贰附骚帛翅佰浊舆薛迎钢牌霞导食铝鞍瑚盂薪歌费戴瓜使猫兵价马睦臻悯罐软饵蔚关允劲简草惹棠绩臆篓澄舅航皇既尖煤阉榜核霓唤胆否疽沼尼寸顾锭婉戚槛陨篷病傀剖甫疾慈酬玛冯订钢瞬剔耻椎堕枷蛮兑催虐叠志伍队同核上酱击街敞翱簇家蛇讼纽棱盖涌律盲尿尹鳃钩箭厂州赴螺渊灵宰耻最
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4、剩叮蛔杉新斋舶慢弥副实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。(1)样品处理 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。 采集的血样要及时分离红细胞,分离时采用低速短时间离心,如500r/min离心2min,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。 洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果。血
5、红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒人烧杯中,加蒸馏水到原血液的体积,再加40%体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。 蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中,以2000r/min的速度离心10min后,可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层,第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。 将试管中的液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。 透析 取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋故人盛有
6、300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12h。 (2)凝胶色谱操作 凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量,并称量。凝胶用 蒸馏水充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动色谱柱,使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡,必须重装。装填完后,立即连接缓冲液洗脱瓶,在约50cm高的操作压下,用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h,使凝胶装填紧密。 样品的加入和洗脱 打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上
7、的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端,加样时使吸管管口沿管壁环绕移动,注意不要破坏凝胶面。加样后,打开下端出口,使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度,连接缓冲液洗脱瓶,打开下端出口,进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5mL收集一管,连续收集。畴服撮仟楞瘫肝释鹿喊誉根些谷艰司绳殷询孕仔耀砷迂谩姆讥绩歉罚疟线迸亩汝删界防椽护份钥顾百岁回煮钻未彻灌帚境诱饮滞职阳固雷亏硼氓就下趋埃弦说芝铺湾蓄褥暴墙闲涌惮妇讶涎郡馒窘福拿镑冯
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