最新[精品]《天然药物化学实验讲义》优秀名师资料.doc
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1、精品天然药物化学实验讲义华北煤炭医学院药学系 吴少杰 编 生药与天然药物化学教研室 2006年12月目 录 实验须知1 实验一 薄层板的制备、活度测定及应用2 天然药物化学成份预试验5 实验二 实验三 辣椒红色素的分离8 实验四 茶叶中咖啡因的提取与分离10 实验五 粉防己生物碱的提取分离与鉴定12 实验六 大黄中大黄素的提取、分离和鉴定16 实验七 槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定19 实验八 从洋金花中提取分离东莨菪碱和莨菪碱24 实验九 丹皮酚的提取、分离和制剂鉴别27 附录一 常用试剂及配制方法30 附录二 各类天然成分的鉴别方法34 实验须知 天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重
2、要组成部分,是使学生进一步理论联系实际,掌握天然药物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能,提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。 天然药物化学实验课实验周期长、使用有机溶剂品种多,用量较大,所用的药品多数是挥发性、易燃、有腐蚀性、刺激性,实验操作经常在加温、减压下进行,需要使用各种热源和电器,再加上实验室较为拥挤,若操作不慎,易引起着火、触电、中毒、爆炸等事故,为确保实验安全顺利进行,特作如下要求: 1(遵守实验室制度,维护实验室安全,不违章操作,严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。 2(实验前作好预习,明确实验
3、内容,了解实验的基本原理和方法,安排好当天计划,争取准时结束。实验开始前应检查仪器是否完整,装置是否正确,检查合格后方可开始实验。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据,应立即如实记录。 3(实验室中保持安静,穿戴整齐。不许大声喧嚷,不许抽烟、吃东西,实验课不迟到、实验进行时不得擅自离开。 4(实验时要做到整齐、清洁、节约用水、用电、药用试剂。用过的仪器要及时清洗并收入仪器柜内,保持水、仪器、桌面、地面四洁。公用仪器及药品用完后立即返还原处,破损仪器应填写破损报告单,注明原因。严格药品用量。废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内,绝不能丢入水槽、下水道和
4、窗外,以免堵塞和影响环境卫生。 5(不得擅自使用明火,需使用明火时,实验台周围不得放置易燃有机溶剂,如发生火情应保持镇静,立即报告指导教师同时切断火源,移走易燃品,用湿布闷盖或用灭火器进行灭火,切勿轻易用水,以免扩大火势。 6(回流、蒸馏有机溶剂时,注意检查冷凝水是否通畅,装置不得密闭,接收有机溶剂时不得使用广口仪器,溶剂瓶不得敝口存放。在进行减压操作时,必须使用安全瓶,弄清操作程序,以免造成回水等事故。 7(使用电器设备(如水浴锅、紫外灯、旋转蒸发仪、循环水泵等)一定要按操作规程进行,不得在烘箱内干燥带有易燃性有机溶剂的仪器或物品,仪器发生故障时及时报告指导教师,不得擅自拆卸。 8(使用挥发
5、性试剂或喷显色剂时,应在窗口或通风橱内操作,不慎溅在桌面上的化学药品必须立即清除。身体直接接触化学物品后应及时用肥皂及大量水冲洗,如碱性试剂可用1%HAc溶液冲洗,酸性试剂可用3%NaHCO3溶液冲洗。不要用酒精、丙酮等洗涤皮肤上的有机物,以免增加皮肤对有毒物质的吸收,眼睛内溅入化学试剂后,应立即用大量水冲洗,及时到校医室就诊。 9(实验完毕后,每次实验结果后的产品,应妥善包装好,贴上标签(写明实验人、日期、样品名称、纯度、mp、bp、TLC、重量等)。放入干燥器内保存,不得随意丢失。课后认真总结,按时完成实验报告。 10(采取学生轮流值日,每次实验完毕,值日生负责整理公用仪器、药品,将实验台
6、、地面打扫干净,倒清废物缸,查看水、电和门窗是否关闭,经教师检查后方可离去。 1 实验一 薄层板的制备、活度测定及应用 实验目的 1(掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法 2(了解吸附剂活度测定的原理及方法 实验方法 一、薄层板的制备 1(不加粘合剂的薄层涂布法 (1)氧化铝薄层 将吸附剂置于薄层涂布器中,调节涂布器的高度,向前推动,即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层,取表面光滑,直径统一的玻璃一支,依据所制备薄层的宽度、厚度要求,在玻璃棒两端套上厚度为0.31mm的塑料圈或金属环,并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环,以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向,操作时,将氧化
7、铝粉均均地铺在玻璃板上,匀速向前推动。 (2)纤维素薄层 一般取纤维素粉1份加水约5份,在烧杯中混合均匀后,倒在玻璃板上,轻轻振动,使涂布均匀,水平放置,待水分蒸发至近干,于100?2?干燥3060分钟即得。 (3)聚酰胺薄层 取锦纶丝(无色干净废丝即可)用乙醇加热浸泡23次,除去腊质等。称取洗净的锦纶丝1克,加85%甲酸ml,在水浴上加热使溶,再加70%乙醇6ml。继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的,用清洁液洗净的玻璃片上,并自然向周围推匀,厚度约0.3mm,薄层太厚时,干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上,使盘中的水蒸汽能熏湿薄层,盘子加玻璃板盖严密,薄板
8、放置约1小时完全固化变不透明白色,再放数小时后,泡在流水中洗去甲酸,先在空气中晾干,后在烘箱中0?恒温加热活化15分钟,冷后置干燥器中贮存备用。 2(加粘合剂薄层的涂布法 (1)硅胶G薄层 取硅胶G或硅胶GF一份,置烧杯中加水约5份混合均匀,放置片刻,随即用药匙取一定量,分别倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中,推动涂布),均匀涂布成0.250.5mm厚度,轻轻振动玻璃板,使薄层面平整均匀,在水平位置放置,待薄层发白近干,于烘箱中100?活化0.51小时,冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整,一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时,所用薄层板只在空气中自然干燥,不经活化即可贮存备
9、用。 (2)硅胶(H)羧甲基纤维钠(CMC-Na)薄层 取羧甲基纤维素0.2g,溶于25ml水中,在水浴上加热搅拌使完全溶解,倒入烧杯中,加薄层层析用硅胶(颗粒度1040m的约68g)。激光照排系统混成均匀的稀糊,按照硅胶G薄层涂布法制备薄层,或取0.8%羧甲基纤维纳10ml,倒入广口瓶(高约1012cm)中,然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克,不断振摇成均匀的稀糊,把两块载玻片面对面结合在一起,这样每片只有一面与硅胶糊接触,使薄片浸入硅胶稀糊中,然后慢慢取出,分开二块薄片,将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上,2 让其自然阴干,100?下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀
10、糊可贮存在广口瓶内,以供再用。 氧化铝薄层,氧化铝羧甲基纤维钠薄层的制备方法同上,一般所需要氧化铝比硅胶稍多。目前国内外市场有预先制好的薄层板,底板用玻璃、塑料、铝片等。可按需要用玻璃刀划割,也有用剪刀剪成所要的大小,使用方便,价格贵些。 3(特殊薄层的制备 根据分离工作的特殊需要,可制成以下几种特制薄层。 (1)酸、碱薄层和pH缓冲薄层 为了改变吸附剂的酸碱性,以改进分离效果,可在吸附剂中加入稀酸溶液(如0.10.5N草酸溶液)代替水制成酸性氧化铅薄层使用,硅胶微呈酸性,可在铺层时用稀碱溶液(如0.10.5N氢氧化钠溶液)代替水制成碱性的硅胶薄层。当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺
11、层,制成一定pH缓冲的薄层。 羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.51%浓度,宜预先配制后静置,取其上层澄清溶液应用,则所制备的薄层表面较为细腻平滑。常用0.8%浓度。CMC-Na系中粘度。300500厘泊(粘度单位)。CMC-Na系碳水化合物,调制时应在水浴上进行。活化温度不应过高,防止碳化。 (2)络合薄层 硝酸银薄层的制法,可在吸附剂中加入525%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状,再按常法铺成薄层,制成薄层避光阴干,于105?活化半小时后避光贮存,制成的薄层以不变成灰色为好,在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解,再用甲醇稀释成10%溶液,把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟,取出避光阴
12、干,按上法活化,贮存。 二、吸附剂的活度测定 1(氧化铝活度的测定 一般可用45种偶氮染料以薄层层析法进行测定。 染料试剂的配制:取偶氮苯(Azobenzene)50mg,对甲氧基偶氮苯(P-Methoxyuzobenzene),苏丹黄(Sudan I, Benzeneazo-naphthol),苏丹红(Sudan ? Tetrazobenzol-naphthol),对氨基偶氮苯(P-Aminoazobenzene)各20mg,分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳(经氢氧化钠干燥)中。 常法制备不含粘合剂氧化铝薄层,以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端23 cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点
13、,各吸取约0.02ml染料试剂分别点滴于原点上,以四氯化碳为展开剂,展开时薄层板与容器底部交角为1040?之间,展开后测出各斑点的Rf值,从表1确定氧化铝的活度(一般高活性氧化铝?级活度使用本法时,结果往往偏低)。 表1 氧化铝活度与偶氮染料外值关系 氧化铝活度级Rf值 偶氮染料 二级 三级 四级 五级 偶氮苯 0.59 0.72 0.85 0.95 对甲氧基偶氮苯 0.16 0.45 0.69 0.89 苏丹黄 0.02 0.25 0.87 0.98 苏丹红 0.00 0.10 0.35 0.50 对氨基偶氮苯 0.00 0.05 0.08 0.19 另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块,置于水蒸
14、汽饱和容器内,23小时后取出,3 按上述方法测定活度。观察有无变化。 2(硅胶活度的测定 一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。 欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄(Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene)。苏丹红(Sudan ?),靛酚蓝(Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline)的苯溶液各10l点滴于硅胶G或硅胶H薄层上,以苯为展开剂,展开10cm(约20分钟),三种染料应明显分离,靛酚蓝斑点接近于起始线。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间,则认为
15、薄层板活性符合要求。 国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标G是Gypsum石膏的缩写。表示加了石膏),硅胶H(H明的意思是:硅胶G(表示不加石膏),硅胶GF254(F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰)。硅胶GF365(表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉)。氧化铝则类推。 四、薄层层析的应用 薄层层析法在天然药物化学成分的研究中,主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识,可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后,可将一些杂质分离,选择性高,可使预试结果更为可靠,不
16、仅可通过显色获知成分类型,而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。 例一:湖北贝母生物碱成分的TLC检识 吸附剂:硅胶CMC- Na薄层 样品:湖北贝母总生物碱氯仿溶液 展开剂:C6H5-EtoAc-NHEt2(6:4:1) 显色剂:改良碘化铋钾喷雾 例二:丹参色素的TLC检识 吸附剂:硅胶G-CMc-Na板 样品:丹参乙醚提取液 展开剂:石油醚-醋酸乙酯(9:1) 记录TLC结果 4 实验二 天然药物化学成份预试验 (共4学时) 实验目的 一、熟悉各类天然药物化学成分的理化性质 二、掌握天然药物化学成分的鉴别方法 三、了解各种不同的中药材所含的主要化学成分 设备与材料 中药材粉末、各种检测
17、试剂、水浴槽、回流装置、抽滤装置、蒸发皿、试管等。 实验项目 中药中所含的化学成分种类很多,因此在研究一种中草药的有效成分,首先应大致知道其中含有哪些类型的化学成分,如生物碱、皂苷、黄酮类等。一般可先进行简单的预试验,以便对今后的提取分离工作提供一定的参考。预试验的方法一般可分为两大类:一类是根据研究的需要,重点检查某类成分,进行单项预试验,例如需要寻找含生物碱类成分,仅需进行生物碱的定性反应,以检查生物碱的存在与否;另一类是系统试验法,即选用简单的定性方法对中草药中各类成分进行较为全面的试验。 预试验室采用中草药初步提取、分离后加入检出各类化学成分的试剂,观察反应现象以判定结果。 由于植物提
18、取液颜色大多较深,各种检出反应的颜色变化在试管内观察时难以判明正或负反应、有些定性反应常为几类成分所共有,有时又可由于成分间的相互干扰或由于定性反应本身的局限性(如反应的灵敏度较差等)等原因,所以预试验的结果只能作为参考,尚需进行薄层或纸层析,将各类成分展开后,再喷定性的显色剂加以判断,灵敏度可进一步提高。 一、试液的制备预试验项目 1、水浸液:取中草药粗粉5g,加水50ml,在50-60?的水浴上加热1小时后,抽滤得滤液,做以下实验: 苷或多糖 有机酸 酚类 鞣质 氨基酸 蛋白质 皂苷 生物碱 糖 酚醛缩pH滤纸茚三酮双缩脲酚醛缩泡沫试碘化铋1.1% 1.1% FeCl FeCl 合反应 检
19、验 试剂 反应 合反应 验 钾试剂 33试剂或费林试溴甲酚明胶试硅钨酸 6N盐酸 反应 剂 绿试剂 验 试剂 林氏试 剂 2、乙醇提取液:取中菜肴粗粉10g,加5-12倍量的95%乙醇,在水域上加热回流提取1小时,过滤得滤液(如果原料含有很多叶绿素,可将乙醇滤液加水稀释成70%的浓度,摇匀后倒入分液漏斗中,加少量石油迷或汽油震荡,使叶绿素转到上层石油醚中,分出70%乙醇液)。滤液留2ml作(1)项试验,其余回收乙醇至无醇味,并浓缩成浸膏状,浸膏分为二部分,加少量2%HCl溶解,溶液作(3)项实验,烧瓶内的一部分再以少量乙酸乙脂溶解,溶液置分液漏斗加适量5 5%NaOH振摇,使酚性物质及有机酸等
20、转入NaOH水溶液中,剩下的乙酸乙脂为中性部分,用蒸馏水洗去碱性即可备用,将乙酸乙脂液2-3ml在水浴上蒸干,以1-2ml乙醇溶解作(1)项实验。 (1)项实验 检查项目 酚类 糅质 有机酸 试剂名称 1%FeCl 1%FeCl 溴甲酚绿试剂 33(2)项实验 检查项目 生物碱 碘化铋钾试剂 试 硅钨酸试剂 剂 名 糅酸试剂 称 苦味酸试剂 (3)项实验 检查项目 黄酮 蒽醌 1.1% AlCl 10%KOH 3试 剂 盐酸镁粉反应试剂 0.5%Mg(Ac)试剂 名 称 氨气 (4)项实验 检查项目 香豆素与萜类内酯 强心苷 开环与闭环反应试剂 Kedde试剂 试 剂 氨基安替比林-铁氰化钾
21、三氯醋酸试剂 名 称 羟氨反应试剂 苦味酸试剂 3、石油醚提取液:取中草药粗粉1克,加10ml石油醚(沸程60-90?),放置2-3小时,过滤,滤液静置表面皿上任其挥发,残留物做下述实验: 检查项目 甾体或三萜类 挥发油和油脂 试 醋酐-浓硫酸实验 剂 石油醚提取液滴于滤纸片上,观察名 有无油斑并在加热后能否挥发 25%磷钼酸试剂 称 二、圆形滤纸层析预试法 取一张圆形滤纸,在距离圆心1.0-1.5cm周围用毛细管加样品。一张滤纸可同时点8-10个样品,待溶液挥发后,在滤纸中心穿入一纸芯,然后放在培养皿中,使纸芯与展开剂接触,滤纸上面再覆盖另一培养皿,进行层析。当溶剂前沿接近培养皿边缘时,取出
22、滤纸,挥干溶剂,将滤纸各层析带剪开,各纸片喷上不同的显色剂,根据滤纸上出现的颜色斑点来确定样品的成分。 展开剂:先以甲醇或95%乙醇为展开剂,展开后喷以显色剂,如发现有生物碱、黄酮类、皂苷等化合物的存在,可用长滤纸重新点样,分别用以下几种专用展开剂展开并显色,以确认这些化学物的存在。 6 专用展开剂: 1、生物碱:氯仿-甲醇(96:4) 2、黄酮类化合物:15%的乙酸 3、皂苷、强心苷和糖类:正丁醇-乙酸-水(4:1:1) 4、其它化合物:苯-无水乙醇(8:2) 显色剂: 常用的显色剂如下表: 酯类、香检查 甾体和蒽醌及生物碱 酚类 有机酸 豆素及黄酮类 强心苷 氨基酸 项目 三萜 其苷 其苷
23、 碘化铋2%铁氰0.1%溴5%磷钼异羟钨紫外(荧氨气熏 先喷2%0.2%茚 钾试剂 化钾与酚兰试酸乙醇蒜铁试光),再二硝基苯三酮醇 2%FeCl剂 溶液 剂 喷加酸乙醇溶液 3 等量混1%AlCl溶液,再3 合 显色剂喷 (荧光增4%NaOH 强与否) 乙醇溶液 显 5%KOH 盐酸乙1%硫酸氨气熏 色 醇 铈试剂 剂 3% FeCl 1%乙酸3乙醇溶镁甲醇液 溶液 1%乙酸 镁甲醇溶液 思考题 1、中药材的水提液、醇提液和石油醚提取液可能提取出何类成分, 2、如何提高中草药化学成分与实验的检测灵敏度, 7 实验三 辣椒红色素的分离 (共4学时) 红辣椒是辣椒Capsicum annum的成熟
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