第13章基因工程与PCR名师编辑PPT课件.ppt
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1、查 嗜 箔 抹 傅 龄 汇 桔 釜 碧 妙 渡 杀 晴 霓 嵌 屡 堤 升 搓 惹 裤 逢 皆 赢 褐 帮 嵌 鹊 昔 盆 圃 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 生物化学生物化学CAICAI课件课件A A 第13章 基因工程与PCR 作者高新旺祁新芝 河南省周口卫校 沙 乎 启 侄 追 穴 撂 候 绚 颐 浚 港 绪 胰 付 柜 扬 滁 氖 座 钉 情 孜 席 瞩 毙 映 顿 踪 齿 痹 扮 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 目录 学习目标学习目标 PCRPCR技术技术
2、复习题复习题 重点内容:基因工程基因工程 基因工程基因工程 剥 冠 炕 酒 豺 仿 潦 杉 点 戮 蜂 州 送 罪 嚼 舟 梆 汀 喊 吾 泡 粒 半 对 办 目 斥 平 辟 睁 煌 插 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 学学 习习 目目 标标 1.说出基因工程的操作步骤 2.列出基因工程的主要工具酶 3.简述PCR技术的工作原理 4.列出PCR的操作步骤 学时分配 第一节 2学时 第二节 1学时 灾 截 塑 褒 臻 斡 葫 婶 忌 以 衍 趴 凰 粥 跪 咖 卿 瓷 伦 夷 弦 靠 闸 癌 芝 邱 妊 踊 雹 挤 世 艇 第 1
3、3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第一节第一节 基因工程基因工程 基因工程又称重组DNA技术,是对携带遗 传信息的分子进行设计和改造的分子工程,包 括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质 工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴 的学科领域生物技术工程。 锯 终 训 铃 葡 尉 钩 抗 馏 滩 河 搂 酗 可 慧 淌 峡 侄 蔡 烘 闰 猾 呜 别 趣 嘘 日 蓄 阁 威 选 六 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 一、基因工程的相关概念一、基因工程的相关概念 (一)DNA克隆
4、所谓克隆(clone)就是来自同一始祖的 相同拷贝(copy)的的集合;获取同一拷贝的 过程称为克隆化,也就是无性繁殖。通过无 性繁殖过程获得的“克隆”,可以是分子的, 也可以是细胞的,动物的或植物的。在分子 遗传学领域所谓的分子克隆专指DNA的克 隆。 暇 碰 拱 符 赛 瞧 好 级 嫌 蟹 轩 训 怒 安 秃 再 懒 绞 箔 忍 疡 遁 智 岂 菩 芳 复 碉 镁 揩 丁 沽 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R DNA克隆就是应用酶学的方法,在体外将各种来 源的遗传物质同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA与载体D
5、NA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子复制子(replicon),继而通过转 化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细 胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子,既 DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增 特异性基因,因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。 克隆某一基因或DNA片段过程中,将外源DNA插入载 体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA,所 以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重 组DNA技术,又称基因工程。 猖 主 彬 愤 樟 葵 尾 含 漂 鹊 糙 看 赶 宙 拖 硷 阮 讫 赁 锈 接 抉 邪
6、 步 埠 拧 俊 核 氰 淘 允 运 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R (二)工具酶 在重组DNA技术中,常需要一些工具酶进行基 因操作。 1限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别 特异的DNA序列,并在识别位点或其周围切割双 链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内 ,种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有 1800种以上,常用的有几十种。现列举某些限制 性核酸内切酶如下页表(其命名是根据含有该酶 的微生物种属而定,如从淀粉液化芽孢杆菌H株 分离出的第一种限制酶命名为Bam H)。 痹 晋 群 琐 谨 佑 河 郡 吝 送 战
7、 纶 偏 苦 栈 硝 撒 泻 勋 穗 禽 侍 存 乏 具 锤 问 逆 冲 老 印 枝 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 下表:限制性核酸内切酶 5G GATCC3 5A GATCT3 5G AATTC3 5A AGCTT3 5G CGG3 5 GATC3 5GA TATG3 名 称识别序列及切割位点 切割后产生5突出末端: BamH Bgl EcoR Hind Hpa Mbo Nde 叠 月 太 妇 拄 咏 绳 庙 钥 蓟 队 当 困 藩 滩 灾 僳 棘 叙 焦 领 候 糯 椽 棺 普 锑 迂 益 辙 斋 汝 第 1 3 章 基 因
8、 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 续表:限制性核酸内切酶 名 称 识别序列及切割位点 切割后产生3突出末端: Apa Hae Kpn Pst Sph 切割后产生平末端: Alu Ecor Hae Pvu Sma 5 GGGCC C 3 5 PuGCGC Py 3 5 GGTAC C 3 5 CTGCA G 3 5 GCATG C 3 5AG CT 3 5 GAT ATC 3 5 GG CC 3 5 CAG CTG 3 5 CCC GGG 3 捉 取 拭 专 驻 衙 汗 沙 吱 噎 壤 尧 湾 憨 余 嚼 废 拥 仟 硫 窍 七 岩 截 崇 笋 和 遁 沦
9、 基 傣 肪 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 2DNA连接酶 DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5 磷酸基和3羟基末段之间形成磷酸二酯键 ,使DNA切口封 合或使两个DNA分子或片连接。 3 DNA聚合酶 其作用是:合成双链cDNA分子或 片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端 4Klenow片段 又名DNA聚合酶大片段,具有完整 的DNA聚合酶的 5 3聚合、 3 5外切活性,。常 用cDNA于的合成,双链DNA 3末端标记等 5反转录酶 其作用是: 合成cDNA 替代DNA聚 合酶进行填补、标记或DNA序
10、列分析 6多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化 或 标记探针 7末端转移酶 在3羟基末端进行同质多聚物加尾 8碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 绦 蛾 咳 锐 绳 努 纬 烦 类 篆 姿 冲 椒 牺 邢 梧 几 掷 驹 膏 讹 父 栅 夜 括 派 豫 椒 朗 庐 授 悲 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R (三)目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣 的基因或DNA序列,或是为获得感兴趣基因的表达 产物蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是 目的基因,又称目的DNA。目的基因有两种类型, 即cDNA和基因组DNA。
11、 cDNA是指经反转录合成的 与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链 DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链 cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整 套遗传信息(然色体及线粒体)的所有DNA序列。 目的基因又称外源DNA。 柜 醒 桂 疡 戮 桩 猴 匣 鞠 奇 掷 喂 珍 憎 厂 坝 笑 报 孤 白 灌 仲 脖 重 拾 媳 奔 肤 吃 且 睁 闻 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R (四)基因载体 基因载体或称克隆载体,是为携带感 兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些
12、 DNA分子。可充当基因载体的DNA分子有 质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。它们 经适当改造后仍具有自我复制能力,或兼 有表达外源基因的能力。 妓 酱 袖 病 摸 没 警 哥 屠 壶 伙 眯 噎 纵 挝 衫 载 悔 谚 哮 撮 衰 婿 霹 斤 县 深 惩 诊 洁 湍 过 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子,小的23kb,大的可达数百kb。质粒分 子本身是含有复制功能的遗传结构,能在宿主细胞 内独立自主的进行复制,并在细胞分裂时保持恒定 地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息,
13、所以会 赋予宿主细胞一些遗传性状,如对青霉素或重金属 的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的 存在,是筛选转化子细菌的根据。因此,质粒DNA 的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操 作,如扩增、筛选过程中都是极为有用的。 蒋 鹃 邑 札 评 幸 邓 塌 龋 进 苔 泰 妙 漱 阔 峰 陪 宿 畦 崇 噪 苯 爸 较 灯 层 苯 患 梁 护 狰 鞘 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R pBR322质粒是稍早构建的质粒载体,其 DNA分子中含有单个EcoR限制性内切核酸酶 位点,可在此插入外源基因。此外还含有 ter 和 a
14、mp两个抗药基因(分别为抗四环 素抗氨苄青霉素) 。这个质粒还含有一个复 制起始点(ori)及DNA复制调节有关的序 列,赋予pBR322质粒复制子特性(见下页图 示)。 常用作克隆载体的噬菌体DNA有噬菌 体和M13噬菌体。 旦 浊 韦 筐 兆 蚌 捌 厨 冒 尧 蔽 硕 疗 富 氓 玄 纲 恩 砌 酮 状 瓮 幻 互 妨 盆 仓 哭 黎 懊 勋 爵 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R pBR322质粒 复制起始点 酶切位点 抗药基因 危 倘 贡 咀 凌 绊 痰 咋 窗 喘 摩 暂 沸 撵 悦 呼 因 坦 黍 稀 做 骄 谱 詹 样
15、 惯 胺 库 处 哥 收 帅 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 二、重组二、重组DNADNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤 一个完整的DNA克隆过程应包括 :目的基因的获取,基因载体的构建 ,目的基因与载体的拼接,重组DNA 分子导入受体细胞,筛选并无性繁殖 含重组分子的受体细胞(转化子)。 以质粒为载体的DNA克隆过程如下页 图所示: 矛 竹 泥 抗 惊 涤 唾 驰 瓶 做 蒂 于 芒 囤 丧 缴 桓 猩 权 睡 琵 货 仇 盅 仲 妨 倾 挣 孤 鞠 抨 瓤 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1
16、3 章 基 因 工 程 与 P C R 下图:以质粒为载体的DNA克隆过程 载体目的基因重组DNA分子 转化 细菌 含重组DNA分子的细菌 重组DNA分子增殖 细菌在培养液中 繁殖后,在固体 培养基中生长 筛选含重组质粒的细菌 武 和 芜 跋 娠 蜡 箕 能 陛 圣 隐 炎 鉴 饭 坛 辱 君 的 窍 图 轻 嚏 浑 歉 焰 卖 嫡 麻 亦 娥 骆 仙 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R (一)目的基因的获取 1化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列可以 利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。 2基因组 DNA文库 分离细胞染
17、色体DNA,利用限制 性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段, 其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆 载体拼接成重组DNA分子,继而转入受体菌扩增,使每个 细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所 包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段 ,这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代 表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带 的所有基因组DNA的集合称基因组 DNA文库。基因组 DNA文库就像图书馆库存万卷书一样,涵盖了基因组全部 基因信息,也包括我们感兴趣的基因。建立基因组 文库 后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含
18、有某一 基因的菌落,在行扩增,将重组DNA分离、回收,获得目 的基因的无 性繁殖克隆(见下页图)。 皋 暇 耶 庇 月 虏 华 谎 晋 聋 玩 伸 琶 镊 锦 疡 踊 跑 盎 酷 迢 族 春 瞄 枯 囊 碱 颂 包 舷 色 贰 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 真核生物染色体DNA 限制性内切核酸酶剪切 20kbDNA片段 与载体连接 引入宿主细胞 基因组DNA克隆 上图:基因组DNA文库的构建 刨 弧 妻 磨 歧 猴 务 坦 渔 赔 拷 脓 颧 趣 悯 辟 听 剐 姿 稿 堤 种 起 贪 灰 撒 菩 傻 驳 牢 蓖 七 第 1 3
19、 章 基 因 工 程 与 P C R 第 1 3 章 基 因 工 程 与 P C R 3 cDNA文库 以mRNA为模板,利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA ),再复制成双链cDNA片段,与适当载体 连接后转入受体菌,即获得cDNA文库(见 下页图示)。由mRNA制作的cDNA文库包 含了细胞表达的各种mRNA信息,自然也 含有我们感兴趣的编码cDNA 。然后,采 用适当方法从cDNA文库中筛选出目的 cDNA 。当前发现的大多数蛋白质的编码 基因几乎都是这样分离的。 剔 撮 瘸 黄 彭 砌 烬 溺 舅 嘻 画 钡 荆 凌 充 诉 约 姻 往 浓 勾 胯 浙 莹 梯 底 特 恐
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