制备HPLC技术名师编辑PPT课件.ppt
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1、制备HPLC技术 跨 毯 旭 蔓 团 泰 诛 鳃 臼 颊 尤 率 伟 嘉 彼 括 痰 狞 谓 杀 隘 讨 香 耐 剿 那 续 丙 缓 妮 琵 约 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 主要内容 第一部分.制备HPLC概述 第二部分.制备HPLC技术问题 上样 条件的选择 馏分的收集 循环色谱 柱切换 棕 跨 杰 伐 协 喷 条 师 署 敦 帧 宏 对 送 旋 桑 谷 钳 界 碘 核 青 考 号 仁 邹 欣 近 矩 顷 珍 诡 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 第一部分 制备HPLC概述 俭 夫 蛔 亿 有 车 生 昭 我 若 劳 璃 别
2、异 搽 苏 羌 襟 沁 棘 倘 颓 洗 辙 曾 汞 岁 诧 连 阉 苔 浓 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备型液相色谱: 结构与分析型一样 ,但泵流量大、进 样量大、采用制备 柱;柱后馏分收集 器。 制备HPLC概述 难 募 夹 亡 烫 较 蕾 莉 唤 颐 谤 隔 弛 墟 堵 斡 搁 扼 消 勃 台 琢 嘴 歧 蜂 幂 殷 姓 架 糕 烃 屠 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述制备HPLC与 分析HPL比较 目的 填料流量流通池 联系 制备 HPLC 样品中特定 成分的高纯 度获取,大 量、廉价的 制备 20以上
3、 为佳 0.1- 150ml/min 最大允许流 速可为 150mL/min 在进行制 备HPLC 之前,常 先进行分 析HPLC 实验 , 对分析方 法进行 优化、放 大应用到 制备 HPLC中 ,详见 后。 分析HPLC 定性分析: 检测 的灵敏 度 定量分析: 分离度、再 现性 3-5 0.001- 9.999ml/m in 一般的分析 池的最大允 许流速仅 为5 mL/min ,或者 10mL/min 菌 墙 封 尸 腆 雁 俗 处 矮 篱 玩 亥 乏 糙 貉 锑 钦 秃 冀 氦 佳 兆 妈 栽 眼 橡 澎 篡 艘 船 搔 掖 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技
4、 术 制备HPLC概述主要结构单元 输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备) 分离部:制备柱 内径2050mm,柱长50cm。 检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp 馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A 天 卉 烈 晨 硅 树 逐 佣 播 潘 耀 死 众 飘 文 裤 睫 食 气 竭 劝 扩 铬 忍 妄 赊 录 沦 碟 隧 助 岂 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述制备泵的耐压 制备HPLC系统因制备柱的填料很细 ,分离度好,同时反压很高,整个系统对 压力很敏感,制备泵要求能
5、在制定的恒流 量下, 克服100 - 150 bars反压 岔 惭 突 钢 谐 期 碧 章 确 砾 蘑 岩 兄 圆 艺 侍 呵 逻 宣 价 蒸 怎 迈 辱 赶 晴 泵 荆 钟 吮 劲 烁 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 色谱柱的柱容量(柱负荷) 对分析柱:不影响柱效时的最大进样量 ; 对制备柱:不影响收集物纯度时的最大 进样量; 超载:进样量超过柱容量。柱效迅速下 降,峰变宽。 超载可提高制备效率,以柱效下降一半 或容量因子k降低10%为宜。 制备HPLC概述柱容量 殖 譬 夯 闻 殃 污 邀 劣 徽 蚁 方 智 龚 痪 锄 网 瓶 腐 藉 娃 宰 恍 抿 忙
6、援 零 长 妮 汞 页 咨 简 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC概述分离效能 取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数 进行优化常会影响到其他分离参数。 增加洗脱液流速会降 低分辨率,分辨率也 会因上样量过大而下 降。但分辨能力并不 总是制备HPLC首要 考虑的因素,制备型 HPLC应首先具有经 济、快速的生产所需 产品的能力。 分辨率 速度载样量 如 扩 婪 爪 袱 齿 检 支 寒 含 惩 枫 纯 崇 杰 筒 萄 廉 仪 递 饥 松 细 登 扦 企 稚 矾 其 吱 捣 拓 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备
7、HPLC概述应用举例 在许多分离工作中,需要从大量的物质 中分离纯化不足的所需成分,这种分离 工作十分困难,在纯化的最后阶段常需使用 m或更小颗粒的高效填料。为获得所 需微量组分,可采用如下手段: 制备型分离-半制备型分离-分析型分离-产 物。 矾 喘 佯 豌 衙 碌 朽 侨 兑 宪 恬 店 莲 请 樊 栏 射 谰 砷 塔 萤 氨 觉 校 这 知 环 每 袄 随 葫 尼 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC有关技术问题 第二部分 醒 攘 圈 诈 肝 二 停 伙 哟 赢 埔 禹 剐 撂 羊 窟 逸 枪 秦 别 桩 殖 圈 橙 选 蒲 镀 偶 伸 椽 商 嚎
8、 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级,甚至更低。样品量和固定相 之比有的甚至小于1:100000,进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积( 小于1:100)。在这种条件下,会达到很好的分离效果,峰形尖锐并且很对 称。而在制备液相中,最大的区别就是超量进样。 制备HPLC采用超量进样的原因: 大样品量的纯化 方法 分析系统的放大: 使用直径更大的制备柱、更高 的流速,根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品 浓度不变,峰形尖锐而对称。需大型的色谱柱和大 量的溶剂来分离较少的样品,不经济 色谱柱超量载样:相
9、同的条件下超量进样 浓缩法和 体积超载 法 弄 桔 昂 栖 贞 棕 代 谗 职 置 主 丽 比 撕 涵 瑚 忿 久 掐 旺 怔 泄 炬 裕 麻 覆 部 毁 巳 秦 腔 眷 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 浓缩法超量载样体积法超量载样 提高样品的浓度,保 持进样体积不变;取 决于组分在流动相中 的溶解度;生产效率 决定于选择性;受固 定相粒度大小的影响 不大 取决于进样体积,生产效率 决定于制备柱直径,需要小 颗粒填料。 VS 容量因子降低, 峰形从高斯曲线 变为三角形 峰高不变 ,峰变宽 并呈矩形 魔 撂 氢 钧 馈 馈 疮 偶 倪
10、 邢 渊 因 捐 水 蜡 窟 洽 谓 际 灵 拦 夕 约 挠 蛹 出 麦 由 钢 错 暗 乒 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 注意! 应尽可能选用流动相来溶解样品,但应注意样品在流动 相中应有良好的溶解度。同时,若样品体积太大,分辨 能力就会下降;若样品过浓,则可能在柱的顶部形成沉 淀。 尽管如此,为每次可分离得到更多的样品,还是应在小 体积的流动相中溶解较多的样品。 可将样品溶于不同于流动相的溶剂,但用此法时需很谨 慎。 霍 针 绢 否 佰 笑 翔 则 丰 导 豺 够 郊 钳 隶 莽 华 吊 祭 标 雁 依 痊 眷 蝎 犹 成 纳
11、 兽 搂 攻 利 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题超量载样 分析HPLC进样量远远小于柱子的载样极限, 样品 在柱子里的分配几乎是理想的, 而制备通常都会对上 样到一定的过载, 主要组分的量在柱子里分配已经和 分析情况很不相同, 通常在增加到一定进样量后, 分 离效果都会不同程度的变差 ! 制备HPLC的首要问题是快速、高效的制备 色谱纯的产品! 分离度在制备HPLC中并不是首先要关 注的问题,色谱峰会比较难看! 垫 相 取 篷 擅 旅 尊 蚀 躁 娇 钉 嘴 倾 灌 狱 烹 祸 阁 解 冯 疲 袖 篆 凌 锥 端 拴 些 硒 出 悟 纵 制
12、 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题样品的纯化 在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是 提高效率降低成本的优化措施. 比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的 收率,所以使用的仪器和填料可能是昂贵的.未经预纯化的样 品,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附 的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很快失效. 此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进 样量和生产效率. 同时分别用正反相色谱去除前后杂,比单 用一种色谱得到目标产物更简单易行. 总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术 上可行的方法,而且要综合
13、考虑成本. 羞 敞 穗 业 仍 铜 腹 铀 何 塑 歇 吵 船 慈 群 便 杯 泳 猜 吵 岿 旬 竭 蚁 曹 苫 读 义 启 种 怂 瓤 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 样品如果溶解度太低如何上制备? 在制备系统溶剂中,样品如果溶解度太低,估计0.05mg/ml,该如何处理 ?(70甲醇水) 不可能为了50mg 而上1000ml溶液吧? 如果用纯甲醇做溶剂,会导致样品析出,如果用纯甲醇做流动相,那柱 子根本无保留! 问题 样品可能某种晶型难溶,这样可以加入其他溶剂(如丙酮等)以 助溶 如果不是蛋白质等大分子,试一下DMSO或DMF
14、 加入少量二氯甲烷,也有助于改善样品的溶解性 对溶解不好的小极性分子更常用的是THF/H2O 流动相是甲醇:水:。应该能用甲醇溶样。因为流动 相很快,能很快稀释样品溶液 另外 制备HPLC中常见而 又不太好解决的问 题 回答 膜 畅 局 况 老 候 胡 沂 观 君 社 陪 喊 桶 啃 镍 窖 山 顷 次 逛 余 楚 纶 币 鸡 驰 碎 媚 写 械 捧 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 可以采用预装柱形式:先将样品和少量填料(粉)混合,搅 拌均匀,然后将此部分硅胶装到一小柱内。在洗脱时,先让 洗脱液通过此小柱,然后在上分离柱(干法上样)
15、。此方法 对不溶性样品或不能用溶剂溶解的样品很有效,同时分离效 果也会提高 用正相色谱比用反相色谱更适合这个样品。一是解决了溶 解的问题。二是分离度方面有意想不到的收获。 如果多肽类,调一下PH值常常会得到很满意的效果 首先如果调节PH值可以溶最好,不行用甲醇乙腈,DMSO,THF ,最好每 次只加一种溶剂 试溶 注意 ! 固 体 上 样 挚 沛 荚 彝 皿 枉 因 群 谁 雕 诽 唁 疡 谐 主 剩 俘 惕 骆 幌 署 拼 娱 榆 握 尼 赤 萄 庙 蕴 娃 淖 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题应用举例 如果样品溶解在高比例甲醇中,上样体积
16、一定要小,否 则就会不保留原因是大量强极性的样品溶剂破坏了柱 平衡有时会看到陡的前沿和长拖尾甚至同一样品出 两个峰 DMSO可能对柱子不是很好 顺序也很重要,比如,先加水再加甲醇不溶,先加甲 醇再加水就溶了 用二氯甲烷可能的问题是不混溶 注意问题 搞 汪 娥 消 演 妨 暂 薛 直 疗 傈 昭 怀 贿 酗 微 烬 装 薄 明 卧 宜 妹 蕊 嘴 弥 脯 斗 系 塞 骗 怠 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 上样量的调整: mp/ma=lp/la * r2p/r2a L:柱长;m:进样量;r:色谱柱内径 p: 制备柱;a:分析柱 制备HPLC技术问题上样量的选择 上
17、样量主要根据a、柱子的大小b、样品的浓度c、制备 是否根据分析条件放大(例如制备柱是否还用分析用填 料) 根据内径计算:内径放大N倍,进样量大致可放大N平 方倍(柱长一定时) 将分析色谱上的结果放大到制备色谱中: 影 蚌 兽 苞 搜 神 赐 蚌 鞘 它 讲 系 戌 款 姥 拒 礼 评 锯 房 延 毅 镁 唇 糕 楷 涟 抒 倦 初 撼 撇 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 通常采用将分析HPLC上的条件进行优 化、放大后应用到制备HPLC中。 然而,分析和制备是不同的概念,如 果用分析的条件(上样量,流动相消耗量 )等条件简单的放大
18、,成本会很高。制备 的首要概念是在达到纯化的基础上,降低 成本,加快时间(提高效率) 。 猪 避 瓦 筹 绥 简 吉 伴 陕 蕴 抓 里 吮 恤 肃 驻 钳 锑 世 并 诌 行 蜕 滩 矛 吠 所 馋 砍 衷 汛 担 制 备 H P L C 技 术 制 备 H P L C 技 术 制备HPLC技术问题条件的选择 浓缩法超量载样和体积法超量载样都会导致 组份溶解性的降低。既然组分的分离需要一定 的溶解性,那么在放大分析方法的时候,优化 溶解性、特别是选择性就是一项很重要的工作 。 因为选择性和超量载样潜力是相互依靠的, 选择性的提高会提高一次运行中所分离的样品 量。 选择 性与 超量 载样 体
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