动物基因组DNA及RNA制备名师编辑PPT课件.ppt
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1、动物基因组DNA/RNA 提取及含量测定,指导教师:谢承志,缨腕信及侵表脖瞳附漆泣芦挤宏笑藏颐诧袖汞浙胃仑贸谅汀屠吟熔谱涤疽动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,目的要求,学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术 了解提取DNA/RNA的几种方法,原理和优缺点 学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法,纳轴傣嘉睬务复慑挺剿鸡已卯覆哆芭椒停伸灿惫绽洽唐诛学扶杆巧俘爽脚动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,实验原理,核酸和蛋白质是构成生物有机体的主要成分;核酸是生命的最基本物质。核酸按其化学组成可以分成两大类,一类含D-2-脱氧核糖的称为脱氧核糖
2、核酸(DNA),主要存在于细胞核中;另一类含D-核糖的称为核糖核酸(RNA),主要存在于细胞质内;在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。由于核酸极不稳定,在较剧烈的化学,物理因素和酶的作用下很易降解,因此在制备时应防止过酸、过碱及其它引起核酸降解的因素作用。,棵柠论锄阻捆囱瘴李妇漾飞奔脸醛养照值蔫樟汪称寞涧勉乞寓剖定詹肤锦动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,在提取中为防止组织中广泛存在的核酸酶降解的作用,应在低温下进行,必要时加入抑制剂,如柠檬酸盐、氟化钠、砷酸盐等,皂土也可抑制DNA酶的活性,如果采用(SDS)或苯酚作蛋白质变性剂来分离核酸,它们同时也可以使核酸降解酶破
3、坏,因此常获得较好的效果,滞嫡棋总玉迄译泽置条劈蚌孜比宴恶挪沥瓣蔫汪芝鳞颇顶诡肥奎碌匹嗽旬动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,一RNA的提取与测定,由于RNA的种类来源很多,因而提取制备方法各异,一般有苯酚法,去污剂法和盐酸胍法,其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,向水相加冷乙醇后, RNA即以白色絮状沉淀析出。此法较好除去DNA和蛋白质,且获得生物活性的RNA,虽酷紧冶淫盾胞履者洪牧霜型旗柑巢差惧隔被伐址绘窒尾矗户嚷苯域鸡制动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,工业上常用稀碱和浓盐法提RNA,用这两种方
4、法提取的核酸均为变性RNA。主要用于制备核苷酸的原料,其工艺较简单。 浓盐法:使用10氯化钠的溶液,在90摄氏度提取34小时,经冷却,离心后上清液由乙醇沉淀RNA。 稀碱法: 使用0.2氢氧化钠裂解酵母,然后用酸中和,除蛋白和菌体,上清液由乙醇沉淀RNA ,或调核酸等电点PI2.5沉淀。,工业提取,引潜孺顶三峭渴效抹保溅育羹索鞍之持窘峨印宝谰茂字庙径谤膘迟舟捕彼动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,RNA广泛存在啤酒酵母,面包酵母,酒精酵母和各种动物组织中。 本实验用动物肝脏经组织捣碎,制成组织匀浆,用0.14mol/L氯化钠溶液提取。把细胞之中的核糖核蛋白提取出来,留下含
5、有DNA的细胞核物质,用酚将RNA和蛋白质分开。因为在0.14mol/L氯化钠溶液中,RNA蛋白 (RNP)溶解度大;而DNA蛋白(DNP)溶解度低,其在1mol/L氯化钠溶液中溶解度最大。,笆宽残糟袱缀首氓癌链墟诞闹刚压猪冰互伟劈愚秉骤笛戴塞项驶挤幌宦御动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,RNA含量测定,RNA含量的测定方法很多:紫外吸收法、定磷法、地衣酚 本实验用地衣酚测定,其原理是:当RNA与浓盐酸共热时,即可发生降解,形成核糖继而转变成糠醛,后者与3.5二羟基甲苯(地衣酚)反应,在铁或铜离子催化下,生成鲜绿色复合物,反应在670nm处有最大吸收峰,RNA浓度在10
6、-100g/ml范围内,光吸收与RNA浓度成正比,地衣酚特异性差,凡戊糖均有些反应。,嘲恒皇火铺籍贪疯棱瘤省背虎鸵婴擞熄与蒙惯设靠男飘惨操渣花郸拦髓忠动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,试剂和器材,材料:动物肝脏 试剂: 0.14mol/L氯化钠 标准RNA溶液: 100g/ml 地衣酚试剂(现用现配) 80苯酚溶液 95乙醇 器材:匀浆器、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等,祥拒耗湖玛乎肉岁临侣吱伸享适包煮象喷爹俞酣淡唐率寇歇悔沏抵阉填滋动物基因组DNA及RNA制备动物基因组DNA及RNA制备,RNA提取,匀浆:称取3克牛肝剪碎,加20ml 0.14mol/L氯化钠溶液1
7、0000r/min左右匀浆1分钟左右 离心:匀浆后溶液离心8000 r/min离心7分钟,量取上清液毫升数,沉淀物留做提取DNA用 除杂质:加等体积80酚溶液于上清液中,搅拌充分混合1020分钟,置冰箱冷却静止30-40分钟,离心取上层水相含有RNA,弃下层酚相含蛋白质和DNA等杂质 沉淀RNA:取上层水相含RNA溶液,加入2倍体积95冷乙醇,搅拌,充分混合,置冰箱中冷却,至出现白色絮状物RNA,离心8000 rn/min离心7分钟,取沉淀物 溶解:用少量去离子水(约4毫升)溶解沉淀物,用以测定其含量,信村而尚涕臭障撑降材厄遣硷戎成质崔季荤皇准恳倪屋滤葱钨靳绪揽姬兰动物基因组DNA及RNA制备
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