第六章微生物的生长与控制名师编辑PPT课件.ppt
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1、第六章 微生物的生长与控制,【知识目标】 1.了解微生物生长的概念。 2.理解环境条件对微生物生长的影响和控制方法,工业上常用的微生物培养技术。 3.掌握几种常用的微生物生长量的测定方法,微生物的生长曲线及对生产实践的指导意义,微生物的诱变育种和常用的微生物菌种保藏的方法。 【技能目标】 1.能够运用微生物生长量的相关理论知识,完成微生物生长量的测定。 2.能够运用微生物生长规律的相关理论知识,完成微生物生长曲线的绘制,并学会如何运用微生物的生长曲线来指导生产实践。 3.能够运用微生物菌种保藏的相关知识,完成生产菌种的保藏工作。,训拍胡酱斯灾蹿辛娶鳖章饶缉裁硝探烙辆璃戍泵垮淹芽鼠耗寥盐劝舶札篱
2、第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,第一节 微生物的生长,一、微生物生长的概念 微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加,导致细胞体积增大的生物学过程,这是微生物个体生长的定义。 当微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体,即引起个体数量增加,这是微生物的繁殖。 由于微生物个体微小,生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时,往往将这两个过程放在一起讨论,这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加,这是微生物群体生长的定义。,期底沸釉京现煮硼逛索士摇铁嘶跋宝众兜胶蛋走奥晒逆鹊员晃炊萎叶匈篷第六章微生物
3、的生长与控制第六章微生物的生长与控制,二、微生物生长量的测定,(一)微生物细胞数目的测定方法 1细胞总数计数法 细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。 (1)显微镜直接计数法 这类方法是利用特定的血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。,蹭让炭狞埔怔夹舅聋孰球挝鸣虏厉九栋鉴十奔铁辱票愿锨橡甄徊宅诣依妻第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,图6-1 血球计数板和血球计数板计数网的分区和分格,血球计数板是一块特制的载玻片(如图6-1),上面有特定面积(1mm2)和高度(0.1mm
4、)的计数室,在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25个)小格,但整个计数室都是由400个小格组成。,吩袭飞辖彰驰孩跃按例敌燎荧仔汗撩窥洽筷擦任灾兽狰氛洼肇倪衬酣鹿编第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,将稀释的样品滴在计数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计算45个中格的菌体总数,并求出每个小格所含菌体的平均数,再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。,珍航瘤辗鼎巨球蔚伐姐烹岭瘤浴狞恿路声累眉上抿蛤捕去悠站淡禾已左捅第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,(2)涂片计数法 用计数板附带的0.01mL吸管,吸取定量稀释的细菌悬液,
5、放置刻有1cm2面积的玻片上,使菌液均匀地涂布在1cm2面积上,固定后染色,在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出1cm2中的菌数,然后按1cm2面积上的菌液量和稀释度,计算每毫升原液中的含菌数。,每毫升原菌液的含菌数 视野中的平均菌数1cm2/视野面积 100稀释倍数,盯仿鬼姓匹常恢普厌客澄喇承戍锡烩尉坛抒办沽殷公砚泳私殴赤铅轰扼兄第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,(3)比浊法 比浊法是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比,与透光度成反比。细胞越多,浊度越大,透光量越少。因此,测定菌悬液的光密度(或透
6、光度)可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的菌悬液与已知细胞数的菌悬液相比,求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器(如图6-2)。,图6-2 比浊法,此法比较简便,但使用有局限性。 菌悬液颜色不宜太深,不能混杂其他物质,否则不能获得正确结果。,闻狐夷迎素瑰捎渣墅彩箭缎袱芹粱陕呕叼因蜒涝腮懊宝导辈新鸿哥晤虾似第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,2活菌计数法 活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法,故又称平板计数法(如图6-3)。活菌计数法的特点是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度,保证一个活细胞可
7、形成一个菌落。 (1)涂布平板法 用灭菌的涂布器将一定体积(不大于0.1mL)适当稀释度的菌液涂布在琼脂培养基的表面,然后保温培养到有菌落出现,记录菌落的数目并换算成每毫升试样中的活细胞数量。 (2)倒平板法 将样品稀释到一定浓度,取一定体积(0.1mL1mL)倒入冷却至45的固体培养基中混合,然后倒入无菌平皿中制成平板,培养后出现菌落,由菌落数推算出活菌总数。,蒸妨困挫涤拌径灭籽茂固挪懊瑟础童叶赚丰扫斗不叫俐忽逊弦段尽渐粒态第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,图6-3 涂布平板法和倒平板法,序原孤式悠座拦蜒州殉断究惭媳矩僧砒峦裙析挂狡虐畅俄畴沸站淖蹭切纸第六章微生物的生长与控制
8、第六章微生物的生长与控制,(3)滤膜过滤法 当待测样品中菌数很低时,可以将样品通过膜过滤器(如图6-4),然后将膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。,图6-4 滤膜过滤法,务峦厦遭峪洲蝶霄玲坝酿栅桩郑筏芥皮舌腾检云怨平对习霍们霄匀密吏蔑第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,测定微生物生长的相关生理指标,也可以间接的反应出微生物的生长量,常用以下方法来测定。 1重量法 此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。 将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来,经洗涤,离心后直接称重,求出湿重。如果是丝状体微生物,
9、过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水,再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品,可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内,于105烘干至恒重,取出放入干燥器内冷却,再称量,求出微生物干重。一般说来,干重为湿重的10%20%。,(二)微生物生理指标的测定方法,鹊唱棘奉砍色蔗冕着工紊汞规渭掂竣莹世抚惯痔慕厢值针漱商嘲昨易锦算第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,2体积测量法 体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法是取一定量的待测培养液(如10mL)放在有刻度的离心管中(如图6-5),设定一定的离心时间(如5min)和转速(如5000
10、rpm),离心后,倒出上清液,测出上清液体积为V,则菌丝浓度为(10-V)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。,图6-5 刻度离心管,汹格碑瞒坟不赠吭卧纠扒渴滋窘皋鸡响冒矛冯藉笑侩工啪徐帕伺归矣习桃第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,3测定菌种细胞内化学成分 测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂,操作困难,但较准确,菌种细胞内化学成分的多少,可反映出群体中菌体数量的多少。 (1)测定含氮量 微生物细胞的含氮量一般比
11、较稳定,所以常作为生长量的指标,大多数细菌的含氮量为其干重的12.5,酵母菌为7.5,霉菌为6.0。根据其含氮量再乘以6.25,即可测得其粗蛋白的含量(包括了杂环氮和氧化型氮)。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%80%,一般以65%为代表,因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算:,孩默链草局盎强渤咕昔蜒纳椽浙恨庄凹厦画强拱笼狡霄踢晃款髓猫卓幻裤第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,(2)氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去,加入上清液18%的中性甲醛,反应片刻,加入0.02N的NaOH使之变
12、色,根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况。 (3)其他生理物质的测定 P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸、产气、产CO2(用标记葡萄糖做基质)、耗氧、黏度、产热等指标,都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物活性等方面的测定反映微生物的生长。,起航裴袁躺舌骋充迹渍狙尾龋哟蹈搀襄老迪兢伪嘻贰他缀备快溅敞搜锈资第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,(4)商业化快速微生物检测法 微生物检测的发展方向是快速、准确、简便、自动化,当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理,结合
13、不同的检测方法,设计了形式各异的微生物检测仪器设备,这些仪器设备正逐步应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如全自动微生物快速检测系统(如图6-6)可以在数小时内获得监测结果,样本颜色及光学特征都不影响读数,对酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏感。,图6-6 全自动微生物快速检测系统,块恿促琼竖胁戊百仅葛胳命柯昆橡功芳乔蠢哑说侨庄蓟唱孵卯棺击骤酚绊第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,对于丝状微生物,特别是丝状真菌,通常是通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率,主要采用的有如下几种方法。 1培养基表面菌体生长速率测定法 培养基表面菌体生长速率测定法主要测定一定时间内在琼脂培养基表面
14、菌落直径的增加值。一般采用载玻片培养法,方法如图6-7。,图6-7 载玻片培养法,(三)菌丝长度的测定方法,丸咨纲谩差怠辅状爆肘士扦猖挡鲸赴逢说娥餐劝堰锥砍甄抬评登符蓝录升第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,2培养料中菌体生长速率测定法 主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体生长速率的测定。 3单个菌丝顶端生长速率测定法 具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板的中心,生长一定时间后,将平板置于显微镜载物台上,同时校对所用显微镜的目镜测微尺,并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺与菌丝平行,并选择
15、菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条刻度线重合,这个点即为“参照点”,每隔一定时间测量一次菌丝生长的长度。,图6-8 霉菌菌丝生长(图中的数字为分钟),三腥块背蚕承闽表腮痕经球苫贝溜翱篷雹利习萄哀很院载扔雹任窥汐宛味第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,第二节 微生物的生长规律,研究微生物的生长规律,需要从研究微生物的个体生长和群体生长两个方面着手。 一、微生物的个体生长和同步生长 以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。 目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。 一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片; 二是采用同步培养方法。,苗踪遥哭旦择狄取鹃火竿恍拐赏丰榴伍切屎栗耕
16、岿磋掘介望砌阿峦拷况盟第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。 以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶段,并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。 同步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子,它是一种理想的材料。,师绰斋姜九晒擦牢歌灯胀拣握辈荧募鸣互省苑凛劝虹宅馋耻熄牟喂桥舶父第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,同步培养方法很多,可归纳为机械法与环境条件控制法两类。 1机械法 这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积和质量不同或根据它们同某种材
17、料结合不同的原理设计出来的方法。其中常用的有以下几种方法。 (1)离心方法 (2)过滤分离法 (3)硝酸纤维素滤膜法,图6-9 机械法获得细胞同步培养 a、硝酸纤维素滤膜法 b、离心法,恿檄猜殉阳缀噎恰撒贷膀钠联黄烙豆谅击猪蹭初萧炊桔俗伟哺梗涯铁采暇第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,2环境条件控制技术 这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细胞的方法。 (1)温度:最适生长温度有利于细菌生长与分裂,不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后,通过培养可获得同步细胞。 (2)培养基成分控制:培养基中的碳、氮源或生长因子
18、不足,可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间,然后转移到营养丰富的培养基里培养,能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的、能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里,培养一段时间后,再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。 环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致细胞内某些物质合成,这些物质的合成和积累可导致细胞分裂,从而获得同步细胞。,弯倚肄膘哑蝇弛汲梧田牺副垂池船瘦赐杜绢危劈睫精斩承放铁棋尼控鞘虽第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,二、微生物的群体生长及其规律,微生物个体细胞的
19、生长时间一般很短,很快就进入繁殖阶段,即微生物的群体生长阶段。微生物群体的生长表现为细胞数目或群体细胞物质的增加。工业发酵的过程就是微生物群体细胞新陈代谢的过程,因此研究微生物群体生长的规律对于发酵工业生产具有重要的指导意义。,图6-10 细菌群体形成的过程(图中的数字为小时),透百流漾遭浑试小拣馁蘸寨帐余帘联悔垣戳习硕茫疏阐幽诲摘咸捡盛悲腻第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,如将少量微生物纯培养物接种入新鲜的液体培养基,在适宜的条件下培养,定期取样测定单位体积培养基中的菌体(细胞)数,可发现开始时群体生长缓慢,后逐渐加快,进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段,随着培养时间的延
20、长,生长达到一定阶段后,生长速率又表现为逐渐降低的趋势,随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段,最后转入细胞衰老死亡。如用坐标法作图,以培养时间为横坐标,以计数获得的细胞数的对数为纵坐标,可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线,该曲线则称为生长曲线。,(一)微生物的生长曲线,共磨肉喳擦糟霄冒况惜愉恫烟细碎囱替衔骸奖戮首法嗜拘森臼岩翱腐赞唤第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,从图6-11可见,细菌生长曲线可划分为四个时期,即: 延滞期, 指数期, 稳定期, 衰亡期。 生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中,生长繁殖直至衰老死亡的动态学变化过程。 生长曲线各
21、个时期的特点,反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流,以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。,图6-11 细菌生长曲线,蛊抓怠悦欺秦藏扮心影叠逗愿瞒喜喉奥鹃迟幻枪奇逊律纪居犀斗广刁毗桥第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,1延滞期 这是培养基接种之后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入新的培养环境时,必须重新调整其小分子和大分子的组成,包括酶和细胞结构成分,以适应新环境,因而又有调整期之称。这个时期表现曲线平坦稳定,细菌繁殖极少。工业生产上应尽可能缩短延滞期。延滞期的长短因菌种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异,一般为14小时,通常可采取处于快速生长繁殖
22、中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、种子培养基与下一步培养用的发酵培养基的营养养成分以及培养的其它理化条件尽可能保持一致等措施,可以有效地缩短延滞期,缩短发酵周期。此期中细菌体积增大,代谢活跃,为细菌的分裂增殖、储备充足的酶、能量及中间代谢产物的重要时期。,(二)微生物的生长曲线各阶段说明,娟其苟蚀承球辽肋悉染彦滨番排虑奄税咖舒珐携梁偶享煌诚抗欺袜奴撕歪第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,2指数期 指数期又称对数期(如图6-12),此期在生长曲线上表现为活菌数直线上升,细菌以稳定的几何级数快速增长,若以乘方的形式表示,即为2n;这里的指数“n”则为细胞分裂
23、的次数或增殖的代数,也即一个细菌繁殖 n代产生 2n个子代菌体,此时期可持续几小时至几天不等。此期细菌形态、染色性、生物活性都很典型,对外界环境因素的作用敏感,因此在研究微生物的代谢和遗传时,宜用这个时期的细胞;在微生物发酵中以该生长后期的细胞作为种子,接种合适的发酵培养基可以缩短延滞期,从而缩短发酵周期,提高劳动生产率与经济效益。,图6-12 生长曲线的指数期,庶泛甭抓蜒泥婚爵煎除祭盖辱件辅坑篱侵匆硒盲鼠误近驾宵疯纠侮驶薄谚第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,培养基中细胞的最初个数和对数式生长一段时间后的细胞个数之间存在如下关系: N= N02n 式中: N 细胞最终数目 N0
24、 细胞初始数目 n 指数生长期细胞繁殖代数 细胞每分裂一次所需要的时间称为代时,以符号 G表示, G t/n。t是指数生长期时间,可从细胞最终数目(N)时的培养时间t2,减去细胞初始数目(N0)时的培养时间 t1 而求得,即t= t2 t1。 因此,如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数,就可以计算出 其繁殖的代数(n),计算方法如下:,袋貉逢想职幕死叔缆收蝗据拦锌椅油隔坞软显摇啊酣扇带亦胶免熔戴炙瘴第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,海踌球第片嘶懒靠扰根鹊恩捆伏舔侨骋投嘴压懈闯谴还龟甲过谣盈姥水糟第六章微生物的生长与控制第六章微生物的生长与控制,3稳定期 由于培
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