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1、2株番木瓜根际促生菌的解磷解钾作用植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,简称PGPR)指生存于植物根际系统,并能促进或调节植物生长的一类微生物,通常具有固氮、溶磷、解钾、产生植物激素、分泌抗生素等生理活性1-4。目前,研究比较多的是PGPR的解磷、解钾、固氮功能。磷和钾是植物生长必需的大量营养元素,而我国土壤中可供植物直接吸收利用的磷、钾资源有限,在生产实践中,为了提高作物产量,每年都要向土壤中施入大量的可溶性磷肥和钾肥,造成土壤板结、地力下降、环境污染、农产品品质下降等问题5。PGPR在其生命活动过程中通常能将土壤矿物质中难以被植物吸收的磷
2、、钾释放出来,转化成易溶性的养分,提升有效磷、有效钾的供应水平,促进植物生长。随着人们环保意识的日益提高,应用PGPR的解磷解钾能力促进植物生长及提高其产量越来越受到关注,PGPR作为一种宝贵的资源逐渐成为研究热点6。番木瓜(Carica papaya L.)是热带、亚热带地区广泛栽培的多年生常绿大型草本植物,别称万寿果、木瓜,果实含有丰富的糖类、胡萝卜素、木瓜酶,富含钙、磷、钾等矿物质,还具有清除自由基、增强人体免疫力、抗病原体等保健作用7-8。目前,PGPR解磷解钾作用在许多作物上的应用已得到诸多报道,但在番木瓜上的应用却鲜有报道。因此,开展番木瓜PGPR菌株解磷解钾能力的研究,对研制新型
3、微生物肥料以提高番木瓜的产量和质量具有重要的现实意义。 本研究从番木瓜根际土壤中筛选出2株PGPR,并对其解磷解钾作用进行分析,旨在为进一步研究番木瓜PGPR的生态适应性,研制番木瓜的微生物肥料提供理论依据。 1材料与方法 1.1仪器与试剂 所用仪器主要有超净工作台、电热恒温鼓风干燥箱、立式压力蒸汽灭菌器、恒温培养振荡器、原子吸收分光光度计、紫外-可见分光光度计、高速冷冻离心机、电子分析天平、纯水机、恒温水浴锅、多功能梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、微波炉、乙醇灯、1 L移液器;所用试剂主要有琼脂、琼脂糖、蛋白胨、酵母浸出汁、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、2Taq PCR MasterMix。 1
4、.2土样 采自云南省西双版纳州普文镇的番木瓜地,土壤系番木瓜的根际土壤。 1.3培养基 1.3.1菌株分离纯化培养基菌株的分离纯化采用牛肉膏蛋白胨培养基(NA)。 1.3.2解无机磷培养基(1)解无机磷固体培养基:葡萄糖1000 g,Ca3(PO4)2 5.00 g,MgCl2 5.00 g,MgSO4?7H2O 0.25 g,KCl 0.20 g,(NH4)2SO4 0.10 g,琼脂15.00 g,溶于去离子水中,加热溶化,混匀,加去离子水定容至1 L,调pH值为7.4,分装于250 mL锥形瓶中,121 灭菌20 min,分装。(2)解无机磷液体培养基:除缺少琼脂外,其他物质含量与解无机
5、磷固体培养基相同。 1.3.3解有机磷培养基解有机磷固体培养基: (1)蒙金娜基础培养基。葡萄糖10.00 g、(NH4)2SO4 050 g、MgSO4?7H2O 0.30 g、NaCl 0.30 g、KCl 0.30 g、FeSO4?7H2O 0.36 g、MnSO4?H2O 0.03 g、CaCO3 500 g、琼脂15.00 g,溶于去离子水中,加热溶化,混匀,加去离子水定容至1.00 L,调pH值至7.4,分装于250 mL锥形瓶中,121 灭菌20 min,分装。 (2)卵黄稀释液。用乙醇擦净鸡蛋外壳,用解剖刀切破鸡蛋两端,流去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中,约加入等量的无菌水,
6、摇匀。 (3)将蒙金娜基础培养基熔化,冷却至50 后,立即加入卵黄液,每100 mL基础培养基加卵黄稀释液34 mL作为有机磷源,混匀后分装于培养皿内凝成平板。 解有机磷液体培养基:除缺少琼脂外,其他物质含量与解有机磷固体培养基相同。 1.3.4解钾培养基(1)解钾固体培养基:蔗糖10.0 g,酵母膏0.5 g,(NH4)2SO4 1.0 g,Na2HPO4 2.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,CaCO3 1.0 g,钾长石粉10.0 g,琼脂15.0 g,溶于去离子水中,加热溶化,混匀,加去离子水定容至1.0 L,调pH值至7.4,分装于250 mL锥形瓶中,121 灭菌20 mi
7、n,分装。(2)解钾液体培养基:除缺少琼脂外,其他物质含量与解钾固体培养基相同。 1.4分离及纯化菌株 取番木瓜根,用无菌去离子水轻柔冲洗,以去除外围土壤,用刷子刷取番木瓜根际土1 g,加入装有100 mL无菌去离子水和若干玻璃珠的锥形瓶中,150 r/min混合30 min,使根际土壤中的微生物细胞充分分散,制作根际土混合液。将根际土混合液梯度稀释后,分别从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度中吸取100 L稀释液涂布于NA固体培养基上,设3个重复。于37 恒温培养箱内培养,根据菌落颜色、形状、大小等特征,观察并挑取不同的单菌落在NA培养基上划线纯化,连续35次划线,获取纯
8、化的菌株,4 斜面保存,备用。 1.5解磷能力的测定 1.5.1解磷能力的平板测定(1)解无机磷:将活化好的菌株点接于解无机磷固体培养基平板上,于37 恒温培养箱中培养7 d,观察透明圈的产生情况,并测量透明圈直径(D)和菌落直径(d),根据D/d值大小?_定解无机磷能力的大小9。 (2)解有机磷:与解无机磷能力平板测定方法相同。 1.5.2解磷能力的摇瓶测定解无机磷:(1)种子液制备。菌株经平板划线活化后,挑取1环接入40 mL NA液体培养基中,以不接菌的NA培养基为对照,37 、150 r/min恒温摇床培养24 d,制备菌液。用分光光度计测定各菌液的吸光度(600 nm),最后用无菌去
9、离子水将各菌液稀释成相同吸光度作为种子液。(2)发酵液制备。按40 mL解无机磷液体培养基接入1 mL种子液接入菌种,同时接入(1)中的NA培养基 1 mL 作为对照,发酵液及对照在37 、150 r/min条件下培养7 d。(3)发酵液处理。发酵液在冷冻离心机下以 8 000 r/min 的转速离心15 min后取上清液2 mL移至50 mL容量瓶中,用钼锑抗比色法10测定发酵液中可溶性磷含量。细菌溶解无机磷的量=发酵液可溶性磷含量-对照培养液可溶性磷含量。 发酵液静置30 min,磷酸钙沉底后,移取2 mL上清液至50 mL锥形瓶中,加H2O2溶液0.5 mL,微波炉加热消解,沸腾后改用小
10、火维持,浓缩至12 mL后关闭微波炉用余热将溶液蒸干,以除掉过量的H2O2溶液,冷却,用5 mL去离子水冲洗锥形瓶内壁,加浓硫酸2滴(约0.1 mL),摇匀后小心转动锥形瓶,使酸液同内壁接触,然后加热12 min,使残渣溶解,溶液剩34 mL并冷却后,转入50 mL容量瓶中,用去离子水定容至50 mL作为待测液。按上述步骤处理对照。待测液8 000 r/min离心15 min,取上清液,用钼锑抗比色法测定发酵液中全磷含量。 解有机磷:与解无机磷能力的摇瓶测定方法相同。 细菌溶解有机磷的量=发酵液可溶性磷含量-对照培养液可溶性磷含量。 1.6解钾能力的测定 1.6.1解钾能力的平板测定将活化好的
11、菌株点接于解钾固体培养基平板上,于37 恒温培养箱中培养7 d,观察透明圈的产生情况,并测量透明圈直径(D)和菌落直径(d),根据D/d值大小确定菌株的解钾能力。 1.6.2解钾能力的摇瓶测定(1)种子液制备。菌种经平板划线活化后,挑取1环接入40 mL NA培养基中,以不接菌的NA培养基为对照,37 、150 r/min恒温摇床培养24 d,制备菌液。用分光光度计测定各菌液的吸光度(600 nm),最后用无菌去离子水将各菌液稀释成相同吸光度为种子液。(2)发酵液制备。按35 mL解钾液体培养基接入1 mL种子液接入菌种,同时接入(1)中的NA培养基1 mL作为对照,发酵液及对照在37 、15
12、0 r/min条件下培养7 d。(3)发酵液处理。发酵液在冷冻离心机下以8 000 r/min的转速离心 8 min,取上清液5 mL用去离子水稀释8倍,使用原子吸收分光光度计测定有效钾浓度。 细菌溶解钾的量=发酵液可溶性钾含量-对照培养液可溶性钾含量。 发酵液静置30 min,钾长石粉沉底后,移取5 mL上清液至50 mL锥形瓶中,加H2O2 溶液1.5 mL,微波炉加热消解,沸腾后改用小火维持,浓缩至3 mL后关闭微波炉用余热将溶液蒸干,以除掉过量的H2O2溶液,冷却,用15 mL去离子水冲洗锥形瓶内壁,加浓硫酸5滴(约0.25 mL),摇匀后小心转动锥形瓶,使酸液同内壁接触,然后加热12
13、 min,使残渣溶解,溶液剩68 mL并冷却后,转入50 mL容量瓶中,用去离子水定容至50 mL作为待测液。按上述步骤处理对照。待测液8 000 r/min离心8 min后,取上清液,用原子吸收分光光度计测定发酵液中全钾含量。 1.716S rDNA基因序列分析 斜面保存的菌株经NA液体培养基摇菌活化后使用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组DNA,保存于-20 冰箱内。以总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物11进行PCR,扩增16S rDNA近乎全长片段。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列为27F:5-AGAGTTTGA
14、TCCTGGCTCAG-3和1 492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。 PCR采用50 L反应体系:2Taq PCR MasterMix 25.0 L,10 mol/L引物各2.5 L,DNA模板1.0 L(20 ng左右),灭菌去离子水补足至50.0 L。 PCR扩增程序:94 预变性5 min;94 变性1 min,58 复性1 min,72 延伸3 min,30个循环;72 延伸 5 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。根据测序所得16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列。通过MEGA 6软件,以
15、邻接法(Neighbour-Joining)构建系统发育进化树,Bootstrap 值为1 00012。 2结果与分析 2.1解磷解钾的平板测定 从云南省西双版纳州普文镇的番木瓜根际土壤里筛选得到2株解磷解钾细菌,编号为PK-1和PK-2。通过固体平板法,根据透明圈直径D与菌落直径d的比值,即D/d值的大小初步测定菌株PK-1和PK-2的解磷解钾能力。由表1可知,菌株PK-1和PK-2在解有机磷与解钾能力方面都存在一定的差异。解有机磷方面,PK-1和PK-2的透明圈直径都超过了12.00 mm,PK-1的D/d值达到3.48,大于 PK-2 的1.46,说明PK-1的解有机磷能力较强;解钾方面
16、,PK-1与PK-2的透明圈直径都超过了21.00 mm,PK-2的D/d值达到1.65,大于PK-1的1.26,说明PK-2的解钾能力强于PK-1;解无机磷方面,PK-1和PK-2均未出现透明圈。 2.2解磷解钾的摇瓶测定 对菌株PK-1和PK-2进行7 d的解磷解钾摇瓶培养后测得发酵液中无机磷全磷与可溶性磷含量、有机磷全磷与可溶性磷含量及全钾与可溶性钾含量(表2)。由表2可知,菌株PK-1和PK-2对无机磷、有机磷和钾都表现出不同的降解作用。解无机磷(磷酸钙)方面,PK-1和PK-2发酵液中全磷的质量浓度分别为4.30、43.65 g/mL,同时PK-1和PK-2的解磷量分别为1.63、1
17、7.26 g/mL,说明PK-2解无机磷的能力明显强于PK-1;在解有机磷(卵磷脂)方面,PK-1 和PK-2发酵液中全磷的质量浓度分别为32.41、10.86 g/mL,同时PK-1和PK-2的解磷量分别为8.49、2.38 g/mL,说明PK-1对有机磷的溶解能力明显强于 PK-2,与固体平板法测定的解有机磷能力的结果一致;解钾方面,PK-1和PK-2发酵液中全钾的质量浓度分别为954、9.01 g/mL,同时PK-1和PK-2的解钾量分别为815、849 g/mL,说明PK-2的解钾能力略强于PK-1,与固体平板法测定的解钾能力的结果一致。 2.316S rDNA基因序列测定及分析 提取
18、的菌株PK-1和PK-2基因组DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,条带清晰,无非特异性条带,可用作16S rDNA PCR扩增的模板。菌株PK-1和PK-2的16S rDNA PCR 扩增采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1 485 bp处有1条明亮的特征条带,并且无其他非特异性条带(图1)。 将菌株PK-1和PK-2的16S rDNA基因测序所得序列,采用Blast进行同源性比较,与GenBank中的核酸数据对比分析,选取同源性较高的代表菌株,以16S rDNA基因序列为基础,构建系统发育树。从图2中可以看出菌株PK-1与肠杆菌属(Enterobacter)的细菌自然聚为1支,它的16S
19、 rDNA序列与河生肠杆菌Enterobacter amnigenus (JQ063000)有较高的同源性,相似度达100%,因此可鉴定菌株PK-1为肠杆菌属。菌株PK-2与芽孢杆菌属(Bacillus)聚1群(图3),它的16S rDNA序列与同温层芽孢杆菌Bacillus stratosphericus (KX262677)有较高的同源性,相似度为100%,因此可将菌株PK-2鉴定为芽孢杆菌属。 3结论与讨论 从云南省西双版纳州普文镇番木瓜根际土壤中筛选得到2株解磷解钾细菌PK-1和PK-2,通过平板测定D/d值和摇瓶测定发酵液中的全磷、全钾含量和可溶性磷、可溶性钾含量评价其解磷、解钾能力
20、。在解磷解钾能力的平板测定试验中,PK-1解有机磷的D/d值为3.48,大于PK-2的1.46;PK-2解钾的D/d值为1.65,大于PK-1的1.26;解无机磷平板里PK-1和PK-2均没有出现透明圈。解磷、解钾能力的摇瓶测定试验中PK-2溶解无机磷的量为17.26 g/mL,明显高于PK-1的 1.63 g/mL;PK-1溶解有机磷的量为8.49 g/mL,明显高于PK-2的2.38 g/mL;PK-2溶解钾的量为8.49 g/mL,略高于PK-1的8.15 g/mL。解有机磷和解钾方面,菌株PK-1和PK-2在摇瓶测定试验和平板测定试验中的解磷、解钾效果基本一致,这进一步验证了固体平板试
21、验的结果,说明溶解有机磷的能力为PK-1PK-2,PK-2溶解钾的能力大于PK-1但不显著;解无机磷方面,菌株 PK-1和PK-2在平板测定试验中均无透明圈出现,但在摇瓶测定试验中PK-1和PK-2表现出一定的解无机磷 能力(PK-2PK-1),造成这种现象的原因可能是PK-1和PK-2的菌体在固体和液体环境中解无机磷能力不同,也可能是因为固体平板中磷酸钙的浓度过大,PK-1和PK-2的菌体溶解了部分磷酸钙但还不足以形成明显的透明圈。解磷解钾细菌在生长过程中能分泌一些物质,并向周围扩散,使菌落周围的培养基中磷酸钙、卵磷脂和钾长石矿粉溶解呈透明状,因而固体平板-透明圈法是判定菌株是否具有解磷、解钾能力的常用方法,适合进行解磷解钾菌的初筛,但存在一定的局限性,使用摇瓶培养测定能对菌株的解磷、解钾能力进行量化,更为准确和科学13-15。 通过16S rDNA对菌株进行初步鉴定,确定菌株PK-1属于肠杆菌属,菌株PK-2属于芽孢杆菌属,而肠杆菌属和芽孢杆菌属是较常见的解磷细菌和解钾细菌16-19。菌株PK-1和PK-2同时具有较强的解磷、解钾能力,这是一些其他的植物根际促生菌所不具备的特性,可进一步研发成为番木瓜微生物肥料生产菌种,具有重要的理论意义和实践价值。关于菌株PK-1和PK-2对番木瓜促生作用及对土壤微环境的影响等有待进一步研究。
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