2种绿藻的玻璃化冻存研究.doc
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1、2种绿藻的玻璃化冻存研究收稿日期:2016-05-31 基金项目:国家自然科学基金(编号:30960215);广西自然科学基金(编号:桂科青0728019);广西民族大学相思湖青年学者创新团队资助项目。 微藻结构简单、繁殖迅速、易于培养、能够产生多种生物活性物质,具有很好的开发前景。藻类的长时间培养容易引起藻种污染,生命力减退以及藻种的基因漂变1-2,给藻种的保存、研究以及大规模培养带来众多不便。目前,在微藻保存中的方法有固定化保存,继代保存和超低温冻存法3。这些方法在实际应用中有其弊端,如继代培养在多次接种过程中藻种容易污染和逐渐老化,生命力减退。固定化保种程序复杂,大多数微藻在培养后期常会
2、从胶珠中溢出4-5。自1985年Rall等首次将小鼠胚胎细胞运用玻璃化冻存的方式成功冻存6以来,玻璃化冻存的应用越来越广。玻璃化冻存技术不仅可以克服在藻种多次接种下导致的污染、基因漂变问题,还可以在超低温条件下杀死有害细菌,实现藻种长期保存的目的7。微藻玻璃化冻存的成功报道也越来越多8-10。小球藻(Chlorella)具有很高的营养价值,胶网藻(Dictyosphaerium)产油脂量较高,对它们进行成功低温保存将为进一步开发利用这2种绿藻奠定基础。本试验对胶网藻和小球藻的玻璃化冻存进行了研究。 1材料与方法 11藻种来源及其培养 胶网藻HE01与小球藻HE07分离于广西沿海红树林的水样中。
3、2种绿藻培养于F2培养基中,在(241)、光照度(440 W日光照射)、光暗周期为12 h12 h的条件下培养。取对数生长后期的藻液用于试验。 12抗冻保护剂的选择 JP3在蔡小宁等的试验方法11上做出改进,选取10% DMSO+10%乙二醇+30%蔗糖+F2培养基为玻璃化冻存液配方。分别在此基础上改变DMSO、乙二醇与蔗糖浓度。DMSO浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%;乙二醇浓度梯度为5%、10%、15%、20%、25%;蔗糖浓度梯度为10%、15%、20%、25%、30%。在单因素优化结果的基础上进行3因素3水平的正交试验,正交试验选用浓度为单因素优化最佳值与左右相邻值。 1
4、3玻璃化冻存 131预处理 将对数生长期的2种藻细胞置于4 的环境下暗培养48 h。提高藻种的耐寒性。 132预平衡 取预培养后的藻细胞4 mL,经离心浓缩后分别加入稀释2倍的玻璃化冻存液和培养基预平衡5 min,离心去除平衡液,迅速加入玻璃化冻存液或培养基分装到2 mL的冻存管中,每管500 L。 133冻存步骤对微藻冻存率的影响 分别将2种藻迅速放入到液氮罐中或者在4 冻存30 min后,移到-20 冻存2 h再移到-80 条件下过夜后投入到液氮罐中。 134解冻和冻存液的去除 将在液氮中保存24 h后的藻种取出,立即放入40 恒温水浴锅快速解冻。化冻后的微藻在无菌条件下室温平衡20 mi
5、n后加入3倍体积培养基离心去除溶液,用培养基重复洗涤23次。 135冻存后的恢复培养 将去除冻存液的藻细胞接种到新鲜培养基中,暗培养1 d后转入到光照培养。 14藻细胞存活率的测定 参照Canavate等的方法12,取恢复培养后的藻细胞接入F2培养基,培养4 d后,采用752型紫外分光光度计测定藻液的D680 nm值。并以未冻存的藻细胞作对照。 存活率=解冻后藻液的D680 nm值未冻存藻液的D680 nm值100%。 2结果 21蔗糖浓度对冻存率的影响 未加入冻存液的2种藻的存活率均为0,可以看出2种微藻对超低温均没有耐受性。随着蔗糖的浓度增加,2种海洋绿藻的存活率显著增加。当蔗糖浓度达到2
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