1株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病的效果.doc
《1株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病的效果.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《1株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病的效果.doc(9页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、1株死谷芽孢杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病的效果植物病害一直是威胁农业安全生产的重要因素,化学农药的长期大量使用一方面使得病原菌产生了抗药性,另一方面对人、畜和环境产生危害,由农药引起的食品安全问题已经受到广泛关注1。因此,采用高效、低毒、环境友好的治理技术来替代传统单一依靠化学农药来防治植物病害是生产中亟待解决的问题。生物防治因其对环境和人畜安全、不易产生抗药性、处理费用低廉等优点,已广泛应用于各种农林病虫害的防治2,4。生物防治(Biological Control)是指利用生物物种间的相互关系,以一种或一类生物抑制、消灭另一种或一?有害生物的防治方法5-6。在生物防治过程中,分离和筛选
2、防效好、活性稳定、环境适应性强的可替代化学试剂的生防菌株资源是保证生物防治效果的前提7。 植物内生细菌是指某一时期生活在活的植物组织内而不引起明显病害症状,并与寄主和谐共存的细菌。植物内生菌作为最具防病潜力与应用价值的一类生防细菌,不仅能够促进植物生长,增加作物的产量,还能提高植株抗病能力,对植物本身而言也不是一个外来物种,从而成为许多学者研究的热点对象8。有资料显示,目前在各种农作物和经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种,分属于54个属,主要为芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、土壤杆菌属(Agrobacteriu
3、m)、泛菌属(Pantoea)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等9,为植物病害的生物防治提供了丰富的微生物资源。近年来内生菌领域的研究已取得一定进展,发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物10。 本研究从番茄中分离筛选到1株对西瓜枯萎病菌具有显著抑制作用的拮抗菌,并结合菌体特征、16S rDNA序列分析及生理生化指标,对拮抗菌进行初步鉴定,确定其分类地位。同时,在温室盆栽条件下对分离的拮抗菌进行抗病效果初探,旨在为生物防治提供菌种资源。1材料与方法 1.1试验材料 供试致病菌株西瓜枯萎病菌(Fusarium oxyporum f. sp. niveum)由江苏省农业科学院产地环境研究室
4、保存。试验中选用的西瓜品种为江苏省江蔬种苗科技有限公司培育的“苏蜜5号”。菌株培养基为马铃薯葡萄糖糖培养基(PDB)和Luria-Bertani培养基(LB)。菌株DNA提取、PCR扩增试剂,均购自宝生物工程(大连)有限公司。 试验仪器为:超净台(苏州净化),摇床(上海知楚),PCR仪(Eppendorf),扫描电镜(蔡司EVO18)。 1.2试验方法 1.2.1菌株的分离、纯化与保存该菌株分离自江苏省农业科学院蔬菜基地大棚内的番茄植株。采集番茄样品后,自来水洗风干,然后依次用75%乙醇浸泡1 min和8% NaClO浸泡4 min进行表面消毒处理,无菌水洗4次后,将根、茎、叶用无菌剪刀剪开,
5、根和茎切成约1 cm的小段,放置于LB平板上;叶加水研磨至糊状,静置10 min后涂布LB平板,均放置于30 培养48 h,选取不同形态特征的单菌落反复平板划线纯化后进行斜面保存。 1.2.2拮抗菌的筛选及广谱性验证采用对峙培养法筛选出对西瓜枯萎病病原菌具有抑制作用的菌株。首先,将尖孢镰刀菌在PDA平板上28 培养5 d,用直径为5 mm的打孔器在平板上打取圆形琼脂块,将其接入PDA平板中央,28 培养2 d,然后用灭菌牙签在病原菌菌饼两侧等距离处点接种分离得到的细菌,于培养箱中28 培养3 d后观察记录抑菌圈。每个处理重复3次,有抑菌圈的菌株即为拮抗菌。为进一步验证分离的菌株对植物土传病害是
6、否具有广谱抑菌效果,选取了如表1所示的另外6种常见的植物病原真菌进行进一步的抑菌试验。 1.2.3拮抗菌的鉴定形态学观察:将分离菌株划线接种于LB培养基,37 培养48 h后观察菌落形态特征。采用结晶紫进行革兰氏染色,并利用扫描电镜观察菌体形态及大小。扫描电子显微镜(SEM)样品制备过程参见林英等的方法11略作调整。固定:取液体培养基中的菌体1 mL,4 000 r/min离心20 min,弃上清,并用生理盐水清洗3次,倒入2.5%戊二醛固定液于4 过夜后,用生理盐水清洗3次。脱水:依次用30%、50%、70%、85%、90%的乙醇溶液梯度脱水处理,各浓度均处理15 min。再用100%的乙醇
7、处理2次,每次 15 min。干燥:吸取混匀的细菌-醋酸戊脂悬浮液滴在盖玻片上,将滴有菌液的盖玻片分别于-70 的冰箱冷冻12 h后,置于冷冻干燥机内真空干燥。扫描:将干燥后的样品放在真空镀膜机内镀金15 min后取出在扫描电镜中进行观察。 生理生化特征分析:37 培养2448 h后,生理生化特征按伯杰细菌鉴定手册12进行鉴定。 1.2.4拮抗菌的16S rRNA序列测定采用常规小量基因组提取方法,采用TaKaRa MiniBEST Bacterical GenomicDNA Extraction Ver. 2.0试剂盒,根据细菌16S rDNA的通用引物27F:5-AGAGTTTGATCCT
8、GGCTCAG-3,1 492R:5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。以过夜培养的wm005菌体基因组为模板进行PCR扩增。PCR运行程序:预变性 94 ,10 min;变性94 ,45 s;退火56 ,40 s;延伸72 ,40 s,共35个循环;总延伸72 ,7 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,得到1条约1 400 bp的特异性片段,样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 1.2.5盆栽试验盆栽试验在江苏省农业科学院日光温室内进行。将西瓜枯萎病菌在PDA平板上培养67 d,用孔径为20 mm的打孔器在培养基上打孔,取10片带菌培养基加入200 mL灭菌绿豆汤培养
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 死谷 芽孢 杆菌 分离 鉴定 防治 西瓜 枯萎病 效果
链接地址:https://www.31doc.com/p-1577825.html