EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)方法的建立和应用.doc
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1、EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)方法的建立和应用猪繁殖与呼吸综合征病毒别称蓝耳病病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,简称PRRSV),属动脉炎病毒科动脉炎病毒属,是一种单股正链RNA病毒,全基因组序列约为15 kb,含9个开放阅读框(ORF),其中ORF1a、ORF1b占整个病毒基因组的80%,ORF1a编码的非结构蛋白Nsp-2蛋白在病毒复制和致病过程中发挥重要作用,ORF2a、ORF2b、ORFs37各自编码病毒结构蛋白GP2、E、GP3、 GP4、 GP5、M、N1-3。PRRSV
2、基因组毒株间具有较大的遗传变异性,根据PRRSV基因型差异,将PRRSV分为美洲型、欧洲型,两者序列同源性约为63%4-5。 由PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)是以仔猪呼吸衰竭和孕猪流产、胎儿畸变、早产、死产及木乃伊胎等繁殖障碍为主要症状的传染病6,以高致病率、高死亡率为主要特征,该病于1987年在美国首次被发现,目前遍布世界各个养猪国家7-8。1992年世界动物卫生组织(Office International Desepizooties,简称OIE)将猪繁殖与呼吸综合征列为B类动物传染病,我国将其列为二类动物疫病9。我国于1996年首次报道该病,主要为美洲型。2006年,PR
3、RSV的高致病性NA型病毒株(HP-PRRSV)在我国各地养猪业中引起大规模疾病暴发,给我国猪群养殖业带来了沉重的经济损失10-11。因此,建立及时快速的PRRSV检测方法,对预防和控制该疫情有重要的作用。 目前用于诊断PRRSV的方法有病毒分离培养、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,这些检测手段存在耗时长、灵敏度低、对感染早期无法确诊等缺点。实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,简称real-time PCR)是一种自动化程度高、特异性强、灵敏度好、可以实时监测整个PCR进程的核酸检测技术,包括荧光杂交探
4、针、荧光染料2类12。染料法实时定量PCR省去了设计、标记荧光探针等流程,检测费用较探针法相对降低,同时适用于各种PCR扩增体系13-14。新型饱和染料EvaGreen 具有很强的荧光信号和稳定性,解决了SYBR Green染料重分布等缺点,是一种适用于实时荧光定量PCR的DNA结合荧光染料15。本研究拟建立1种基于EvaGreen的PRRSV实时荧光定量PCR检测方法,应用于猪繁殖与呼吸综合征的早期诊断,同时也可为猪繁殖与呼吸综合征的诊断、试剂研发、流行病学研究等奠定基础。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1病毒和临床样品PRRSV、猪瘟病毒(classical swine fever
5、 virus,简称CSFV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,简称PCV2)疫苗株由笔者所在实验室保存;猪细小病毒(porcine parvovirus,简称PPV)疫苗干粉,购自北京中海保健科技有限公司;伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,简称PRV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,简称JEV)疫苗干粉,购自武汉科前动物生物制品有限公司。收集来自湖北省、福建省、安徽省、广东省、河南省、浙江省及天津等地猪场的共58份血清样品和在杭州市内不同猪肉市场收集的共60份包括猪肺、淋巴结、肝、肾等组织样品。 1.
6、1.2主要试剂及仪器Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等,购自Sangon公司;Ezol、RNase A、pMD18-T vector、RNase inhibitor、M-MuLV反转录酶、Agarose等,购自TaKaRa公司;EB固体,购自Boehringer Mannheim公司;EvaGreen,购自 Biotum 公司;DNA Gel Extraction Kit,购自Axygen公司。主要仪器:Bio-Rad S1000PCR扩增仪;Tanon 1600凝胶成像分析系统;Nanodrop 2000紫外分光光度计;Fresco 21离心机;ABI 7300荧光PCR仪。 1.
7、2试验方法 1.2.1引物设计从GenBank下载现有的PRRSV全基因组序列,利用DNAstar软件进行序列比对后,结合文献报道,选出PRRSV的特异性保守区域,借助Primer Premier 5.0设计1对引物1,对应扩增产物长度为451 bp,用于构建重组质粒,并在此扩增产物序列范围内再设计1对用于EvaGreen 实时荧光定量PCR的引物2,对应扩增产物长度为88 bp(表1)。引物由Sangon公司合成。 1.2.2PRRSV重组质粒标准品制备 1.2.2.1PRRSV核酸提取及普通PCR扩增根据RNA提取?剂盒要求进行病毒RNA提取。以提取的RNA为模板,按照反转录试剂盒说明将提
8、取产物反转录成cDNA;以获得的cDNA为模板进行PCR反应,在0.2 mL PCR管中依次加入2.5 L 10 Buffer,2.0 L 25 mmol/L MgCl2,各0.5 L上下游引物1,0.5 L 2.5 mmol/L dNTP,0.3 L Taq DNA聚合酶(5 U/L),1.0 L cDNA(约100 ng),加入ddH2O至总体积为25.0 L。反应程序:95 3 min;94 30 s,56 30 s,72 30 s,30个循环;72 10 min。反应结束后,使用DL2000 Marker对PCR产物的目的片段进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.2.2标准品模板构建根
9、据DNA Gel Extraction Kit操作说明书进行产物割胶回收。回收产物参照TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒说明书连接到pMD18-T载体中。将重组质粒转化到感受态细胞DH5内,通过氨苄青霉素(Amp+)培养基筛选,提取重组质粒进行PCR鉴定,并将电泳检测正确的重组质粒委托Sangon公司进行序列测定,将经测序验证后正确的重组质粒用紫外分光光度计Nanodrop 2000 测定浓度,根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数,再按10倍梯度进行系列稀释,制成PRRSV重组质粒标准品。 1.3PRRSV EvaGreen实时荧光定量PCR方法建立 EvaGreen实时荧光P
10、CR反应体系总体积为10 L,反应体系组成:1.2 L 25 mmol/L Mg2+,1 L 10Buffer,0.8 L 2.5 mmol/L dNTP Mix,0.5 L 20EvaGreen,0.5 U Taq酶,各0.2 L上下游引物2,1 L PRRSV重组质粒标准品(模板),加灭菌ddH2O补足体积至10 L。扩增完成后进行熔解曲线制作过程,扩增程序:95 3 min;95 15 s,60 1 min,40个循环。熔解曲线程序:95 15 s,60 1 min,95 15 s,60 开始收集荧光信号,制作熔解曲线。 1.4PRRSV EvaGreen实时荧光定量PCR方法评价 1.
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