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1、KCNJ11启动子区甲基化在2型糖尿病患者中的初步研究Preliminary study of KCNJ11 promoter methylation in patients with type 2 diabetes mellitus LI Wenchong ZHU Yongyao LIU Ruike CHEN Qinglong Department of Endocrinology, Dongguan Third Peoples Hospital of Dongguang, Guangdong, Dongguang 523320, China Abstract Objective To in
2、vestigate the correlation between methylation of partial CpG site in KCNJ11 promoter region and type 2 diabetes mellitus (T2DM). Methods 15 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus and 15 healthy controls were enrolled, DNA methylation levels of 46 CpG loci in 300bp gene promoter 5 wer
3、e measured by sulfite assay in the promoter of KCNJ11 gene promoter. The transcription of KCNJ11 gene was measured by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results In the experimental region of the KCNJ11 promoter region, multiple methylation levels were increas
4、ed. The ratio of total methylation and its expression of mRNA were not significantly different between the two groups (P0.05). Each object of study of the promoter region of KCNJ11 CpG+62, CpG+66, CpG+351 methylation ratio increased, no significant difference between two groups between (P0.05), but
5、increased the methylation ratio of CpG+78, CpG+96, CpG+100, CpG+104, CpG+108, CpG+111, CpG+21, CpG+129, CpG+132, CpG+136, CpG+141, CpG+168, CpG+174, CpG+178, CpG+201, CpG+210, CpG+215, CpG+219, CpG+223, CpG+, CpG+248, CpG+268 233, CpG+270, CpG+272, CpG+288, CpG+324 etc. 26 loci in individual patient
6、s with type 2 diabetes group, while in the normal control group without methylation. Conclusion Methylation of KCNJ11 promoter region is abnormal in type 2 diabetes mellitus, and it may be involved in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Key words Type 2 diabetes mellitus; DNA methylation;
7、Polymerase chain reaction; KCNJ11 2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是指占糖尿病总数95%以上的,以不同程度胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗共存所致的原发性糖尿病。越来越多的研究1表明,遗传与表观遗传机制共同 在T2DM患者的发病过程中起重要作用。有学者研究发现,KCNJ11基因与2型糖尿病的发生发展密切相关,其启动子区甲基化可能在其中?l挥重要作用2。本研究选取2014年4月2015年4月我院初治T2DM患者15例,探讨T2DM患者KCNJ11启动子区甲基化,以及比较在2型糖尿病患者及健康正常对照者的mRNA表达情况,从表观遗
8、传学角度解释T2DM的致病机制。结果令人满意,现报道如下。 1 资料与方法 1.1 研究对象 选取2014年4月2015年4月我院初治T2DM患者15例,为东莞市第三人民医院内分泌科确诊的新发单纯性T2DM患者(依照WHO1999诊断标准),男9例,女6例,平均年龄(57.013.1)岁。同一时间选取年龄、性别匹配的正常对照组15例,选自无糖尿病、自身免疫性疾病及其家族史的健康志愿者;男9例,女6例,平均年龄(56.710.1)岁:75g口服葡萄糖耐量实验(oral glucose toleran test,OGTT):空腹血糖0.05),具有可比性。 1.2 方法 1.2.1 标本收集 选取
9、我院内分泌科初治T2DM患者15例,收集所有受试者晨起空腹静脉血各4mL分别注入EDTA-K2的抗凝管内(2支管各2mL)和干燥管内(1支管3mL),一支EDTA-K2的抗凝管常规分离血浆行静脉血浆血糖测定,干燥管常规分离血浆后取血清行胰岛素、C-肽测定。日立7170A全自动生化分析仪测定血糖,葡萄糖氧化酶法测定血浆血糖,糖化血红蛋白(HbA1C)检测采用高压液相色谱法,运用深圳迈瑞全自动糖化血红蛋白分析仪进行检测。德国西门子ADVIACENTAUR CP全自动免疫分析仪化学发光免疫分析法测定血清胰岛素、C-肽。两支EDTA-K2的抗凝管抗凝血备存于-80冰箱行基因测定。 1.2.2 CpG岛
10、预测 KCNJ11启动子区总长度为1417bp,通过http:/www.urogene.org/cgi-bin/met在线软件预测285 910bp(共626bp)是一个CpG富含区域(CpG岛),位于第一外显子下游游用“+”表示,检测5端300bp左右区域,见图1。 1.2.3 BSP-测序 取受试者静脉血1mL,采用基因组DNA提取试剂盒(GENERAY,GK1022)抽提受试者外周血白细胞DNA,紫外分光光度法检测DNA纯度,置于-80冻存待用。应用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN,cat:59824)按照说明 书进行DNA亚硫酸氢盐修饰处理,未
11、甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐修饰后变为尿嘧啶,甲基化的胞嘧啶不改变。MethPrimer软件设计甲基化KCNJ11引物(见表1),引物由GENERAY公司合成。PCR扩增总体系50L,加入经亚硫酸氢盐修饰的DNA模板2L,2PCR buffer 25L,上下游引物各1L,用双蒸水调整至终体积为50L。PCR条件及设定反应程序:95预变性4min;94变性30s,55退火30s,72延伸40s,运行40个循环;72修复延伸5min结束反应。PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,挑取阳性克隆送GENERAY公司测序。BSP扩增基因包含46个CpG位点,本研究设定原始系列中所有的CpG都是甲基
12、化的,经亚硫酸氢盐修饰后KCNJ11修饰序列所有的CpG均不发生改变,以避免原始序列中的TG感染甲基化率,见图2。使用Vector NTI 8 软件对比序列,研究发现甲基化发生在第+62位、+66位、+351位3个CpG位点上,因此,以甲基化胞嘧啶(mC)克隆数目/10100%计算个体甲基化率。 1.2.4 QPCR检测 用HiPure Blood/Liquid RNA Kit(Magen,R4163)提取外周血白细胞RNA,按Reverse Transcription System(Promega,A3500)试剂盒说明书进行逆转录。QPCR扩增总体系20L,加cDNA模板1.5L,GoTa
13、q qPCR Master Mix (Promega,A6002)10L,上下游引物(见表1)1L,用双蒸水调整至终体积为20L。PCR条件及设定反应程序:95预变性120s;95变性15s,60退火延伸30s,运行40个循环。 1.3 统计学分析 符合正态分布的计量资料采用()表示,组间比较采用t检测,mRNA相对定量结果比较用秩和检验,相关分析用Spearman相关分析。采用SPSS17.0统计学软件进行分析,P 2.2 T2DM组与健康正常对照组KCNJ11启动子区甲基化位点及水平比较 两组出现甲基化的位点37个,2型糖尿组甲基化的位点是健康正常对照组的3.18倍,CpG+78、CpG+
14、96、CpG+100、CpG+104、CpG+108、CpG+111、 CpG+121、 CpG+129、 CpG+132、CpG+136、CpG+141、CpG+168、CpG+174、CpG+178、CpG+201、CpG+210、CpG+215、 CpG+219、 CpG+223、CpG+233、CpG+248、CpG+268、CpG+270、CpG+272、CpG+288、CpG+324等26个位点的甲基化比率在2型糖尿病组的个别患者中有所升高,而在健康正常对照组却未出现甲基化,两组间总甲基化水平无明显差异(t=1.0323;P0.05),各组均有甲基化的位点分别为CpG+62、CpG
15、+66、CpG+351,见A图,该三个位点在正常组,甲基化比率分别为(58%24%)、(46%17%)、(96%8.944%);在2型糖尿病组分别为(60%18%)、(41%18%)、(99%4%),正常组与2型糖尿病组的三个位点甲基化比率均无明显差异(t=0.2582,0.7821,1.1859;P0.05),见B图。正常对照组mRNA与2型糖尿病组mRNA相对定量结果比较无明显差异(F=0.2534;P0.05)。 2.3 KCNJ11基因启动子区甲基化与蛋白质表达的关系 直线回归分析显示,2型糖尿病组患者KCNJ11基因启动子区甲基化率高于健康正常组,而由KCNJ11基因编码内向整流型钾
16、离子通道蛋白Kir6.2表达则低于健康正常组,甲基化程度与但标志表达呈显著负相关(r=-0.93,P 6 郭毅飞, 李雪锋, 李敏,等. 餐后有氧运动对初治肥胖2型糖尿病患者糖脂代谢、胰岛素抵抗及瘦素水平的影响J. 疑难病杂志, 2016, 15(7):706-709. 7 高翔, 靳二虎. 肝脏脂肪沉积与2型糖尿病相关性研究进展J. 临床和实验医学杂志, 2015,11(5):428-431. 8 Gallardo?Blanco H, Villarreal?Perez J, Cerda?Flores R, et al. Genetic variants inKCNJ11,TCF7L2andH
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