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1、siRNA介导的FOXA2基因沉默对乙肝病毒复制的影响DOI:10.11876/mimt201602019 乙肝病毒(HBV)引起的传染性疾病。HBV是双链环形结构1,3.5kbRNA包含C(核抗原)/P(DNA多聚酶)/S(表面抗原)/X(X蛋白),是HBV进行复制的关键因子。FOXA2-3是核转录因子,由FOXA1、FOXA2、FOXA3构成。FOXA是肝转录因子之一,在肝器官的形成和发展及肝进行新陈代谢过程中发挥重要作用。FOXA也是HBV复制的关键调控点,因为HBV病毒所有的启动子和增强子均包含FOXA结合位点。大量实验表明HBV转基因鼠中转入FOXA2,HBV复制降低,进而推断FOX
2、A2可以抑制HBV的复制。因此我们设计靶向FOXA2的siRNA序列,构建质粒转染人肝癌细胞HuH-7,观察FOXA2基因沉默后对乙肝病毒复制的影响。 1 材料 质粒载体(上海吉凯基因公司);jetPRIME Transfection Reagent (Polyplus );Trizol(Invitrogen);核酸提取试剂盒(庄盟国际生物基因公司);Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes(Thermo Fisher Scientific company);HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit (北京康为世纪生物公司);Golden v
3、iew(庄盟国际生物基因公司);-Actin单克隆抗体(Cell Signaling company );FOXA2抗体(Abcam company);miRNA Northern blot reagent (TAKARA company);ECL显色试剂盒(Thermo Fisher Scientific company )。 2 方法 2.1 细胞培养 HuH-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37、5% CO2 条件下孵育箱内培养。EDTA胰酶消化HuH-7细胞,取对数生长期细胞实验。 2.2 细胞转染及筛选 将1.5105 HuH-7细胞接种于6孔板中,37、5% CO2 孵
4、育箱中过夜。待HuH-7细胞贴壁覆盖率70%80%时,换新培养液,将含FOXA2-siRNA的质粒与jetPRIME转染试剂按1:2混合滴加到6孔板1、2、3孔细胞上。同时将不含靶序列空质粒与jetPRIME转染试剂按照同样比例滴加到6孔板4、5孔细胞上。第6孔为阴性对照只加培养液(阴性组)。转染3周后挑取单克隆进行鉴定。将FOXA2基因沉默细胞株命名为F-S细胞株;空质粒细胞株命名为K-S细胞株。提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞基因和蛋白,用QT-PCR、RT-PCR及Western blot对siRNA介导FOXA2基因沉默进行验证。 2.3 QT-PCR、RT-PCR 法检
5、测FOXA2基因mRNA 表达 用Trizol试剂1mL分别裂解F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株;加入0.2mL氯仿,颠倒混匀待两液相分层后离心,取上清液至新EP管中;加与上清液等体积异丙醇混匀,室温放置20min,离心弃上清;加入无水乙醇离心弃上清液并风干;加入30L RNAase-free ddH2O,反复吹打混匀,获得细胞总RNA,经反转体系得到cDNA。QT-PCR条件:底物液12L,H2O7.5L,引物(FOXA2、Actin)2L,模板2L。RT-PCR对FOXA2基因引物进行扩增,条件如下:98 10s,6030s,7230s,32个循环。RT-PCR产物用1%琼脂糖
6、凝胶电泳后用凝胶成像仪显示,以ActinPCR扩增作为内参对照。 2.4 Western blot检测FOXA2蛋白变化 用蛋白抽提试剂分别提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞株总蛋白,测定蛋白浓度,用Western blot检测FOXA2蛋白表达。具体步骤:配置分离胶和浓缩胶,蛋白上样,SDS-PAGE 80V电泳3h后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂奶封闭,抗FOXA2抗体(1:500)4过夜,二抗(1:2000)37孵育1h,ECL试剂盒化学发光后曝光成像,同时检测Actin(1:500)表达作为内参对照。 2.5 Northern blot 检测 HBV RNA 表达
7、 用 Trizol 法分别提取F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞RNA。电泳:配置15%尿素变性PAGE胶,将样品与RNA loading按比例混合,705min,立即置于冰上,上样恒压80V电泳;转膜:组装转膜结构滤纸、胶、膜、滤纸,恒压60V转膜1h;杂交:将膜放入杂交管中,加入杂交缓冲液42旋转震荡30min ,弃液加入杂交缓冲液+mRNA探针42旋转震荡30min,弃液加入杂交缓冲液+探针信号扩增素42旋转震荡2h;信号检测:将膜放入显色盒中,封闭30min,加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素40min,加入化学试剂曝光成像。 3 结果 3.1 F-S细胞株 FOXA2基因mRN
8、A水平变化 3.1.1 QT-PCR法检测F-S细胞株沉默效率 图1a为FOXA2基因在F-S细胞株、K-S细胞株、HuH-7细胞中定量表达。对比HuH-7细胞与K-S细胞发现,空质粒基因对沉默效率影响不大,表明其在基因水平对沉默效率影响不显著,而F-S细胞FOXA2基因沉默效率为89%,与K-S细胞相比有显著性差异(P 8 WanH, Kaestner K H,Ang SL, et at.FOXA2 regulates alveolarization and goblet cell hyperplasiaJ.Development,2004 ,131(4):953-964. 9 Besnar
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