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1、不同梯度NaCl胁迫对甜高粱幼苗抗氧化同工酶亚基及酶活性的影响宁夏地处西北内陆,有大面积待开发的盐碱化土地,仅银川北部的盐碱化土地面积已经达到总耕地面积的49%,这已经成为宁夏农业生产的重要影响因素之一1。因此,筛选适合盐碱地种植的作物,充分开发利用盐碱地,对于当地的经济发展和农业生产有着重要的意义。甜高粱别称糖高粱、芦粟、甜秆等,是禾本科高粱属一年生草本植物,为普通粒用高粱的变种,具有抗旱、耐涝、耐盐碱、适应性强、生物产量高、糖分含量高等特点,对土壤的适应能力很强,是名副其实的高效能植物2-3。再吐尼古丽?库尔班等对甜高粱改良盐碱地的效果进行研究,结果表明,种植甜高粱后对盐碱地有非常明显的脱
2、盐效果,种植过程中土壤盐分含量逐渐降低,土壤养分含量也发生明显的变化,其中pH值轻度降低4。随着我国出台的中国可再生能源中长期发展规划的推行,大力发展盐碱地甜高粱等非粮生物质能源作物的种植,对盐碱化土地的有效利用以及能源危机的缓解有重大意义。 当遭受盐碱胁迫时,植物体内会累积较多的活性氧,若不能及时清除就会使膜系统受到损伤,对植物体造成不同程度的伤害甚至死亡。龚明等对盐胁迫下大麦、小麦等叶片脂质过氧化伤害与超微结构的变化研究发现,盐分可以增加膜的透性,增强脂质过氧化作用,最终导致膜系统破坏5。盐生植物或耐盐植物在盐碱胁迫下膜系统的变化过程是先被破坏,然后被修复。植物能否维持其膜系统的完整性,关
3、键在于其修复能力大小,而膜系统的修复与 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性高低是分不开的。SOD、POD、CAT及APX是植物体内的抗氧化酶系统,它们相互协调、共同作用来清除膜脂过氧化作用产生的活性氧和丙二醛,最终达到保护膜结构的作用6,抗氧化系统的协调作用使活性氧簇(ROS)在体内维持较低水平,从而使植物能进行正常生长和发育。 因此,本试验以甜高粱品种M-81E为材料,研究不同浓度的盐胁迫对抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以及同工酶亚基、丙二醛(MDA)含量等生理指标的影响,以探讨甜高粱苗期耐盐的生理机制,对甜高
4、粱的适地种植有重要的指导意义,也为开发利用盐碱地发展生物质能源提供品种资源和理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试甜高粱品种为M-81E,由北方民族大学植物生理实验室提供,选取当年产的籽粒饱满、大小均匀的种子备用。 1.2 试验方法 1.2.1 幼苗培养及处理 种子用自来水反复冲洗后用10%次氯酸钠消毒10 min,常温下用灭菌水冲洗并浸泡8 h,摆放在铺有2层滤纸的培养皿中,置于27 恒温生化培养箱内催芽。等芽长约为3.0 cm时,置于28 光照培养箱内进行光照培养。待苗高约为5cm时,转至自然光条件下用Hoagland营养液培养,每周更换1次培养液。 待甜高粱幼苗长到3叶1心时
5、,将幼苗随机分组,设置0、25、50、100 mmol/L 4个NaCl处理梯度,每个处理设3个重复,于处理后的第2天取叶片提取可溶性总蛋白,用于同工酶电泳检测,于处理后第3、6、12、18天称取成熟叶片0.5 g,用于测定SOD、POD、CAT、APX活性以及丙二醛含量(鲜质量)。 1.2.2 酶液的提取及同工酶电泳 取处理第2天的0.5 g新鲜成熟叶片,加入5 mL冰上预冷的50 mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.0),于冰浴中研磨,4 、12 000 g离心20 min,收集上清液,即为酶粗提液。可溶性总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。同工酶电泳采用北京市六一仪器厂生产的垂直板凝胶电泳仪
6、,电泳时SOD、POD、CAT采用10%分离胶、5%浓缩胶,APX采用7.5%分离胶、5%浓缩胶,上样量35 L,预电泳10 min,浓缩胶中稳定电压为80 V,进入分离胶后稳定电压为120 V,电流为200 mA。于冰浴中电泳34 h,当指示染料下行至距胶板末端12 cm时停止电泳。 SOD同工酶采用氮蓝四唑法染色7,POD同工酶采用醋酸-联苯胺法染色8,CAT采用淀粉法染色9,APX参照邵巍等的方法染色10。根据染色的酶谱计算相对迁移率Rf(Rf=酶带迁移距离/前沿指示剂距离)。 1.2.3 酶液的提取及酶活测定 分别取处理3、6、12、18 d的成熟叶片0.5 g,酶液提取方法及可溶性总
7、蛋白含量测定方法同“1.2.2”节,SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法11,POD活性测定采用愈创木酚法11。CAT、APX活性的测定采用吴倩等的方法12-13。每个处理重复3次,所得数据用Graph Padprism 5.0统计软件分析。 2 结果与分析 2.1 胁迫早期过氧化物同工酶电泳结果 由图1的CAT同工酶染色检测结果看出,与对照相比,当受到盐胁迫时,CAT出现明显的2条带,并且亮度、酶带宽度明显增加,这暗示CAT同工酶基因受到盐胁迫的诱导,表达产物增加。与此同时,检测SOD的同工酶条带,结果表明,随着盐胁迫浓度的增加,SOD的S1亚基条带消失,S2、S3亚基条带亮度减弱,这暗示
8、高浓度的盐胁迫抑制了SOD基因的表达。随着盐浓度的增加,在短时间内APX的A3条带亮度也逐渐增加,并且出现1条较为模糊的条带A2,这也显示相关基因受到盐胁迫诱导。POD染色结果显示,在短时间处理下,POD同工酶出现6条比较明显的条带,这6条带的亮度都随着胁迫浓度的增加而加深,尤其是P1、P2条带亮度和宽度增加比较明显,表明这2个亚基基因对NaCl胁迫更加敏感,能在短时间内受到盐胁迫的诱导。 2.2 不同处理浓度和时间下4种抗氧化酶的活性 2.2.1 不同?理浓度和时间下SOD活性的变化 SOD是重要的抗氧化酶,能够清除活性氧从而防止H2O2的生成,其活性的高低能反映植物耐受逆境环境的能力。在本
9、试验中发现,胁迫初期,低浓度的盐胁迫在一定程度上能够刺激SOD活性增强,由图2可见,随着胁迫时间的延长和浓度的增大,SOD处于被抑制状态,尤其是第18天,对SOD的抑制达到显著水平(P 由于丙二醛是植物在逆境条件下膜质过氧化产物,其含量的高低可以反映细胞膜脂过氧化的程度和植物对逆境条件反应的强弱18-20。在本试验中,甜高粱随着盐胁迫浓度的增大和时间的延长,丙二醛含量的增加趋势与吐尔逊?吐尔洪等的研究结果21相似,推测丙二醛含量的升高,可能与SOD活性的降低有重要关系,但是含量升高不显著,说明甜高粱能够耐受一定高浓度的盐碱胁迫,但是在甜高粱种植生产过程中,为了提高盐碱地的出苗率和成活率,对土壤中盐碱含量和其他背景值的测量比较重要。 4 结论 (1)盐胁迫对甜高粱的抗氧化酶系统进行了修饰,导致SOD活性下降,因此SOD并没有起到清除过氧化物的作用。(2)CAT的同工酶C2亚基,APX的A2、A3亚基以及POD的P2、P3、P4、P5、P6亚基基因受盐胁迫诱导表达,在甜高粱耐受盐碱胁迫中起到重要的保护作用。(3)甜高粱对较高浓度的盐胁迫有较强的适应能力,表现在细胞内的MDA含量没有明显增加,这可能与体内的过氧化物得到及时清除有关。
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