最新不可忽视的细节血液基因组提取-PPT文档.ppt
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1、,DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则,内容,DNA提取原则1:DNA片段长度,没有严格要求 常规PCR,严格要求产物纯度 存档、产物长期保存 Southern杂交 荧光定量PCR SNP Microarray CGH (比较基因组杂交),DNA提取原则2:DNA产物纯度,DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则,内容,基因组提取方法,溶液盐析法:无需酚氯仿,样本量灵活可变,得率高 硅胶膜吸附法:利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸 磁珠法:独特包埋的磁珠,在一定条
2、件下对核酸具有很强的亲和力,而当条件改变时,磁珠释放吸附的核酸,能够达到快速分离纯化核酸的目的。 传统酚氯仿法:传统方法,抽提时间长,成本低。但酚氯仿有毒,危害身体健康。,DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则,内容,样本保存和前处理抗凝血液,保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。 加入抗凝剂混匀后2-8保存一周;20保存一个月;70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在37水浴迅速溶解
3、。 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。,样本保存和前处理非抗凝血,保存 非抗凝血即血凝块。-20保存一个月;-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的血凝块使用前应在37水浴溶解,轻柔颠倒混匀。 2. 血凝块取出后先采取机械破碎的方法(例如:放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆)将血凝块破碎,然后再根据自己的实验取适量样本。,血凝块前期破碎程度越高,提取基因组就越容易!,样本保存和前处理白膜层,保存 全血分离得到的白膜层放置-20或-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液
4、裂解红细胞后得到的沉淀。 2. 冻存的白膜层使用前应在37水浴溶解,轻柔颠倒混匀。 3. 虽然得到的是白膜层,但是会有少量红细胞存在,所以红细胞裂解液 还是必要的,但用量减半。 4. 采用白膜层提取核酸时,所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即:1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。,样本保存和前处理血清/血浆,保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究,例如:肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70保存。尽量避免样本反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的血清/血浆使用前溶解应在37水浴溶解,轻柔颠倒混匀。 2. 血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。 3
5、. 只需100-200ul样本,基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。,样本保存和前处理微量血液/干血点/羊水/胸水,保存 微量血液:抗凝血液-20或-70保存; 干血点:干燥后室温或4保存; 羊水: -20或-70保存。 样本前处理 1. 微量血液处理同抗凝血液,不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。 2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。 3. 羊水/胸水提取时先离心得到沉淀,再进行裂解提取核酸。,样本保存和前处理口拭子/漱口水,保存 口拭子:干燥后室温保存 漱口水:4保存或离心得到沉淀-20或-70保存 样本前处理 1. 拭子将拭子棉头剪入到离心管里,加入缓冲液直接进行提取。 2. 有
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