03细胞生物学的研究方法-PPT课件.ppt
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1、主要内容 l第一节 细胞形态结构的观察方法 l第二节 细胞组分的分析方法 l第三节 细胞培养细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一 光学显微镜技术 1、根据光源不同,可分为: 1)、光学显微镜: 以可见光(或紫外光)为光源 2)、电子显微镜: 以电子束为光源 光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构 2、分辨率(resolution) R = 0.61/n Sin l n=介质的折射率 ;空气为1. 油为1.5 l =样品对物镜角孔径的半角;sin的最大值为1 l =照明光源的波长 l 0.61是一个恒定的参数;表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度 分辨率概念:是指能区分两个
2、物点间最小距离的能力 l 分辨距离越小,分辨率越高,即分辨细微结构的能力越 大 提高分辨能力的方法: l 改变n: n越大; R越小;分辨能力好 l 改变:越小;R越小;分辨能力好 2、放大率 l最终成像的大小与原物体大小的比值 l总放大率=物镜放大率目镜放大率 l例如:目镜10X;物镜40X;则总放大率400X l注意分辨率与放大率的区分 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 分辨本领光源透镜真空 光 学 显 微 镜 300 n m可见光玻璃透镜不需真空 200 n m(油镜) 可见光玻璃透镜不需真空 100 n m 紫外光玻璃透镜不需真空 电子显微镜0.1 n m电子束电磁透镜真空 3、普通光
3、学显微镜构成 照明系统: 光源、聚光器 光学放大系统:物镜、目镜组成;为了消除球差和色差 机械装置: 用于固定材料和观察方便 双筒显微镜 :亮度较单筒暗;双眼观察立体感较单筒强 双筒显微镜 单筒显微镜 (二)、荧光显微镜 (fluorescence microscope) 1、工作原理: l利用紫外线光源(如弧光灯、水银灯等发出) 通过照 明设备把切片或活染细胞透视出来 1)自发荧光 l细胞中有些物质(如叶绿素等)紫外线照射后可 发荧光 2)诱发荧光 l一些物质紫外线照射后不能发荧光,但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发 荧光 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色)
4、2、荧光显微镜和普通显微镜的区别 1)照明方式: l 通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上 2)光源: l 为紫外光,波长较短,分辨力高 3) 特殊的滤光镜系统片 l 激发滤色镜(exciter filter): 光源前的用以滤除不需要的光线 UV(紫外);V(紫);B(蓝);G(绿) l 阻断滤色镜(barrier filter): 目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,保护眼睛 落射式照明原理 荧光显微镜的光通路 尼康E800荧光显微镜 其它类型的显微镜 (三)、激光共聚焦扫描显微境(laser confocal scanning microscope ) l用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐
5、面扫描成像 l分辨力较高,是普通光镜的3倍 激光共聚焦扫描显微镜 LCSM照片 蓝色为细胞核,绿色为微管 (四)、暗视野显微镜 暗视野显微镜(dark field microscope) l用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 l在黑暗的背景下呈现明亮的像 l反差增大,分辨率提高 l观察未经染色的活体或胶体粒子 (五)、相差显微镜 相差显微镜(phasecontrast microscope) l 荷兰人Zernike1932年发明,获1953年诺贝尔物理奖 l 作用:可观察未经染色的标本和活细胞 l基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振 幅差,而提高结构间的对比度 入射光环 共轭区
6、 补偿区(并协区) (六)、偏光显微镜(polarizing microscope) l 检测有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体等 l 光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏 振光 (七)、微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope) l 1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明 l DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope) l 利用的偏振光 ;标本可略厚,折射率差别更大 l 基因注入、核移植、转基因等的显微操作 (八)、倒置显微镜 倒置显微镜
7、特点: l物镜与照明系统颠倒 l观察培养的活细胞 l具有相差物镜 莱卡倒置显微镜 一般光学显微镜的样品制备与观 察 1、 样品的固定(fixation) 目的: 1)杀死细胞,稳定细胞的化学成份 2)使样品在后面的处理和切片时不受到破坏 做法: l最简单是直接浸泡在固定液中 l一般用有缓冲作用的醛类固定液,(甲醛或戊二 醛) 醛类固定液作用机理: l能够与蛋白质的游离氨基形成共价键,而将邻近 的蛋白质分子交联一起 2、包埋和切片(embedding and sectioning) 包埋: l 常用包埋剂:液态的石蜡或树脂 l 使之渗入整块组织,后将之硬化成固体的包埋块 切片: l 切片机切割包
8、埋块,制备成薄切片 l 适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l10 m 切片机进行样品切片 3、染色(staining): 目的: 给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征 一些典型的有机染料 苏木精(hematoxylin): 能显示出细胞内核酸的分布 伊红(eosin):可使细胞质染色 苏丹染料(Sudan dyes)的乙醇饱和溶液:能使脂肪着色 4、有些过程需进行脱水处理 二、电子显微镜(electron microscope) 1、发明 l 1932年德国人Max Knolls和Ernst Ruska发明第一台电 子显微镜 光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构 2、电镜分类 l透射电子显微镜(
9、transmission electron microscope,TEM) l扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM) 光镜与透射电镜的结构 光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较 3、透射电子显微镜基本结构 l 三大部分组成 1、电子光学系统(镜筒): l 照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录 用的照相机等 2、真空系统: 作用: l 防止:阴极与阳极之间会放电, 灯丝也 会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿 命 3、电子学系统(供电系统) l 供电系统,需要高压稳压 TEM的分辨力可达0.2nm 超薄切片:电子束的穿透力很弱 标本厚度约50nm的
10、超薄切片 4、透射电镜制样技术 1)固定样品: l锇酸(OsO4)和戊二醛 2)包埋及超薄切片: l以环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式 推进样 品切片,切片厚度2050nm 3)负染色技术 l用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)对铺展在 载网上的样品进行染色;吸去染料,样品干燥后 样品凹陷处:薄层重金属盐 样品凸出处:没有染料沉积,而出现负染效果 4)冰冻断裂与冰冻蚀刻技术 1、标本置于-100C的干冰或-196C的液氮 中,进行冰冻 2、后用冷刀骤然将标本断开,升温后,冰 在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构, 称为蚀刻(etching) 3、蚀刻后,向断面以45度角喷涂一层蒸汽 铂,再
11、以90度角喷涂一层碳,加强反差和强 度 4、后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂 的膜剥下来,此膜即为复膜(replica) 5、复膜显示出了标本蚀刻面的形态,在电 镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处 的结构 冰冻蚀刻电镜照片 5、扫描电子显微镜 (scanning electron microscope,SEM,) 1)组成 l扫描电子显微镜主要由电子光学系统和显示单元 组成 2)工作原理: A:用细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子 次级电子的多少与样品的表面结构有关 B:次级电子由探测体收集,并被闪烁器转变为光信号 C:再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏 上电子束的
12、强度,显示出与电子束同步的扫描图像 图像为立体形象,反映了标本的表面结构 3)标本制作: l为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、 脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电 子束的轰击下发出次级电子信号 l目前扫描电镜的分辨力为610nm (三)、扫描隧道显微镜 (scanning tunneling microscope,STM) 1、发明 lIBM公司瑞士苏黎世研究所Binning G.和Rohrer H.等在1981年发明 l具有原子显像力的显微镜,是根据量子力学中的 隧道效应原理而制成的 l1986年获得了诺贝尔物理学奖 第二节 细胞组分的分析方法 第一部分 细胞分离技术 一、离
13、心技术 1、应用领域 l研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微 体,以及各种大分子基本手段 高速离心机: l转速为1025Kr/min的离心机转速 超速离心机: l转速超过25Kr/min,离心力大于89K的离心机 2、离心方法分类 (一)、差速离心 (differential centrifugation) (二)、密度梯度离心 (density gradient centrifugation) (一)、差速离心 (differential centrifugation) l在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心 l用于分离不同大小的细胞和细胞器 l在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:核
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