抗生素备课第八章发酵过程的控制-精选文档.ppt
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1、第一节 发酵过程主要控制参数 与微生物发酵有关的参数,可分为物理、化学和生物三类。 一、物理参数 1、温度() 2、压力(Pa) 3、搅拌转速(r/min) 4、搅拌功率(kV) 5、空气流量V/(V min),简称VVM 6、黏度,二、化学参数 1、pH值 2、基质浓度 指发酵液中糖、N、P等重要营养物质的浓度。 3、溶解氧浓度 4、产物浓度,三、生物参数 1、菌丝形态 一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。 2、菌体浓度,参数检测 传统的检测 在线测量:。 抗生素发酵过程中在线测量有许多优点,如及时、省力,且可从烦琐操作中解脱出来,
2、便于计算机控制。 但其应用的困难在于发酵液的性质复杂,一般培养液中同时存在三相,即液、气、固体不溶物或油。,第二节 发酵过程中的代谢变化 微生物培养有:分批培养、分批补料培养和连续培养三种方式。 工业上大都采用分批培养和分批补料培养,特别是分批补料培养。 1、分批培养:指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。,发酵过程的三个时期:,1,2,3,1. 停滞期 2. 对数期 3. 稳定期,时间,细胞数目的对数,1)停滞期 在刚开始接种后的一段时间,几乎未见菌体浓度的增加。工业上要求尽可能缩短延滞期,这可通过使用适当种龄的种子和接种量达到。 2)对数生长期 微生物在此期内的比生长速率最大
3、,细胞数目呈指数生长。 3)稳定期 由于养分的消耗和 微生物产物的分泌,生长速率逐渐减速直至停止。生长终止原因可能是由于某些必须养分的耗尽和自体毒性代谢物在培养基上积累的结果。 在稳定期,许多次级代谢产物在此期合成,因此也称为生产期。,2、补料分批发酵(Fed-batch culture,FBC) 指在分批培养过程中,间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。 3、连续发酵 也称连续流加培养,即培养基料液连续输入发酵罐,并同时放出含有产品的发酵液。由于营养物质的供应与消耗相平衡,培养系统成为稳定的状态。,连续培养优点:能维持低基质浓度,可以提高设备的利用率和单位时间的产量,节省发酵罐的非生产时间,
4、便于自动控制。 但由于培养时间长,难以保证纯种培养。并且菌种变异可能性较大,故在工业规模上很少采用。,第三节 基质的影响及其控制 基质:培养微生物的营养物质。 基质是产生菌代谢的物质基础,既涉及菌体的生长繁殖,又涉及代谢产物的形成。 一、C源种类和浓度的影响及控制 迅速利用碳源: 缓慢利用碳源:,碳源浓度的控制: 采用中间补料的方法控制,包括补糖时间、补糖量和补糖方式。,二、N源种类和浓度的影响及控制 N源:有机N源、无机N源 迅速利用N源: 缓慢利用N源:如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等,对延长抗生素的分泌期、提高产物的产量有好处。 发酵培养基一般是选用快速和慢速利用的混合源。,为了调节菌体
5、生长和防止菌体衰老自溶,除了基础培养基中的N源外,还要在发酵过程中补加N源来控制浓度。生产中采用的方法有: 1、补加有机N源 根据产生菌的代谢情况,可在发酵过程中添加酵母粉、玉米浆、尿素等。 2、补加无机N源 补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机N源,又可调节pH。,三、磷酸盐浓度的影响和控制 微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300 mmol,但对抗生素合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0 mmol,提高到10 mmol,就明显地抑制其合成。 磷酸盐浓度的控制,一般是在基础培养基中采用适当的浓度。对抗生素发酵来说,常常采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响产
6、物合成的量)的磷酸盐浓度。,第五节 温度的影响极其控制 一、温度对发酵的影响 温度的变化对发酵可产生两方面的影响: 一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质;另一方面是影响发酵液的物理性质。,另外,温度有时也会影响菌体代谢产物合成的方向。金色链霉菌进行四环素发酵中,随着发酵温度的提高,有利于四环素的合成,30 以下时合成的金霉素增多,达35 时就只产四环素,而金霉素合成几乎停止。 温度对发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等,都受温度变化的影响,进而影响发酵动力学特性和产物的合成。,二、影响发酵温度变化的因素 Q发酵=Q生物 + Q搅拌 Q蒸发 Q显
7、Q辐射,三、温度的控制 1、最适温度的选择 作为次级代谢产物的抗生素,微生物发酵其最适菌体生长温度和最适抗生素合成温度往往存在差异。 如在2%乳糖、2%玉米浆和无机盐的培养基中对青霉素产生菌进行发酵研究,测得菌体的最适生长温度为30 ,而青霉素合成的最适温度又为24.7 。,又如在林可霉素发酵的不同阶段采用不同的培养温度,对生产菌菌丝形态和发酵单位产生影响。培养起初60维持在31,随后降到30培养70,再回升至31培养至放罐,结果显示:生产菌中、后期菌体浓度下降幅度减小,菌丝上的空泡缩小, 自溶期推迟,发酵单位得到了提高。 因此发酵温度的确定,在理论上,整个发酵过程中不应只选一个培养温度,而应
8、根据不同的阶段,选择不同的温度。在生长阶段,应选择最适生长温度,在产物分泌阶段,应选择最适生产温度。,最适发酵温度还随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段而改变。 如,在较差的通气条件下,由于氧的溶解度是随温度下降而升高,因此降低发酵温度对发酵是有利的,因为低温可以提高氧的溶解度、降低菌体生长速率,减少氧的消耗,从而可弥补通气条件差所带来的不足。 2、温度的控制 由于发酵过程中释放大量发酵热,需要冷却情况较多。 一般情况下,将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中,进行热交换降温。 如果气温较高,冷却水的温度又高,可采用冷冻盐水进行循环式降温。,第六节 pH的影响极其控制 一、微生物细胞生长和代
9、谢产物形成的最适pH值 不同微生物对pH值的要求不同,大多数细菌的最适pH值为6.5-7.5,霉菌的最适pH值为4.0-8.0,酵母菌的最适pH值为3.8-6.0,放线菌的最适pH值为6.5-8.0。 pH值不仅影响微生物的生长,还会影响到代谢产物的形成。,并且微生物生长的最适pH值和发酵产物形成的最适pH值往往不同。如青霉素产生菌生长的最适pH值为6.5-7.2,而青霉素合成的最适pH值为6.2-6.3。链霉素产生菌生长的最适pH值为6.3-6.9,而青霉素合成的最适pH值为6.7-7.3。 二、pH对微生物生长繁殖和产物的形成的影响原因,三、发酵过程中pH值的变化情况 发酵过程中由于微生物
10、细胞在一定的温度及通气条件下,随着微生物对培养基中的营养物质的利用及某些物质的积累,发酵液的pH值会发生一定的变化。 1、在微生物细胞的生长阶段,相对于接种后的起始pH值来说,发酵液的pH值有上升或下降的趋势。,2、在生产阶段,一般发酵液的pH值趋于稳定,维持在最适产物形成的pH范围。 3、在微生物细胞的自溶阶段,随着培养基中营养物质的耗尽,微生物细胞内蛋白酶积累和活跃,微生物趋于自溶,引起培养液中的氨基氮等的增加,致使pH上升。 引起发酵液pH值下降的主要原因有:1)培养基中C/N比例不当,C源过多,如葡萄糖过量或中间补糖过多或溶解氧不足,使糖的氧化不完全,培养液有机酸大量积累,使pH值下降
11、;2)消泡油加得过多;3)生理酸性物质的存在,使pH值下降。,引起发酵液pH值上升的主要原因有:1)培养基中C/N比例不当,氮源过多,氨基氮释放会使pH值上升;2)生理碱性物质的存在;3)中间补料液中氨水或尿素等碱性物质加入过多。 四、发酵过程中pH的控制 1、调节培养基的原始pH值,或加入缓冲溶液制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基,或使盐类和碳源的配比平衡。 2、可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节,进而合理地控制发酵条件。 3、如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时,进行补料是一个较好的办法,既调节,了pH值,又可补充营养,也进一步提高发酵产率。通过补料调节pH值来提高发酵
12、产率的方法已在工业发酵过程中取得了明显的效果。 4、生理酸性铵盐作为氮源时,引起pH下降,可在培养液中加入CaCO3来调节pH值。 但需要注意的是, CaCO3的加入量一般都很大,在操作上容易引起染菌。因此,此方法在发酵过程中应用不是太广。 5、在发酵过程中根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节,同时又把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快,对发酵液的pH值波动影响大,应采用少量多次的流加方法进行流加,以免造成p H值过高,抑制微生物的生长。,6、以尿素作为氮源进行流加调节pH值。 尿素流加引起的pH值变化有一定的规律性,易于操作控制。,第七节 溶氧的影响及其控制 在抗生素生产的有氧发酵中,保证
13、足量的溶解氧浓度是发酵控制的主要因素之一。氧在水中的溶解度很小,在25和1105Pa时,空气中的氧在水中溶解度仅0.25mol/m3左右,能维持微生物菌体1520s的正常呼吸,随之就会耗尽。 在实验室中,通过摇瓶机的往复运动对摇瓶中的微生物供养,而中间实验规模和生产规模的培养装置则需采用通入无菌空气并同时进行搅拌的方式对微生物供养。,通气和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需的氧,并使微生物在培养液中处于悬浮状态以及提高代谢产物的传递速度。 一、发酵过程溶解氧浓度的变化 对多数发酵来说,氧的不足会造成代谢异常,产量降低。溶解氧最易变为发酵中的主要矛盾。 只有了解发酵过程中溶解氧浓度的变化,才
14、能有效地控制发酵的进行。,如金霉素发酵,在生长期中短时间停止通气,就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径,由磷酸戊糖途径转向糖酵解途径,使金霉素合成的产量减少。 1、临界氧浓度 临界溶氧浓度:当培养基中不存在其他限制性基质时,不影响好氧性微生物生长繁殖的最低溶解氧浓度称为临界氧浓度。,而微生物发酵的最适氧浓度与临界氧浓度是不同的。 最适氧浓度:溶解氧浓度对生长或产物合成的最适的浓度范围。 为了避免发酵处于限氧条件下,需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度,并使发酵保持在最适氧浓度范围。这样便可减少批次之间的波动和更有效地利用空气动力。 需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧较高虽然有利菌体的生长
15、和产物的合成,但当溶氧水平太大,有时会抑制产物的形成。,2、溶解氧浓度的变化规律 在设备和工艺条件不变的情况下,发酵过程中溶解氧的变化有一定的规律。 1)在发酵前期:由于产生菌大量繁殖,需氧量不断大幅度增加,此时需氧超过供养,溶氧明显下降,溶氧曲线出现一个低谷。 2)过了生长阶段,一般需氧量略有减少,溶氧随之上升,次级代谢产物开始形成。 发酵中后期,溶氧浓度明显受工艺控制手段的也许,如补料的数量、时机和方式等。如,在补糖后,菌体的需氧量增加,引起溶氧下,降,其下降幅度与菌龄、补糖量及补糖前的溶氧浓度都有关系。如工艺控制不合适,不断地大量补糖,会使溶氧浓度低于临界氧浓度,此时溶解氧就会成为生产的
16、限制因素。 3)在发酵后期,由于菌体衰老,呼吸减弱,溶氧浓度也会逐步上升,一旦菌体自溶,溶氧就会明显地上升。 3、发酵异常时的溶氧变化 发酵过程中若有染菌、污染噬菌体、菌体代谢异常、加油器失灵等异常情况出现,都可能引起溶氧浓度的异常变化。,1)发酵液中污染好气性杂菌,溶氧浓度会在短时间内跌到零值附近,且长时间不能回升,这比用无菌试验来反映杂菌情况要快48h。 2)但不是一染菌溶氧就会有大幅度的下跌,要看所染杂菌的种类和数量,还要看杂菌和产生菌谁占优势。有时染菌也会出现溶氧反而升高的现象,这是因为生产菌受到杂菌抑制,而杂菌本身又非十分好气。这样生产菌的呼吸大为减弱而使溶氧上升。这种情况在污染噬菌
17、体的发酵液中更为灵敏,更早地发出预报。 3)补料或加油在供氧不良的罐内也会引起溶氧迅速降低,若溶氧原来就较低就容易降至零。一般13h溶氧回升,这可与染菌时的溶氧变化相区别。 4)某些设备故障也会引起溶氧的变化。例如自动加油器失灵,大量漏油,会引起溶氧迅速下降。,二、溶解氧浓度的控制 要控制发酵液中的溶氧浓度,从供养与需氧两方面着手。 影响氧传递系数的一些因素 1、搅拌,它能从以下几个方面改善溶氧速率:1)搅拌能把大的空气泡打碎成为微小气泡,增加了氧与液体的 接触面积,而且小气泡的上升速度要比大气泡的慢,相应地氧与液体的接触时间也就增长;2)搅拌使液体作涡流运动,使气泡不是直线上升而是作螺旋运动
18、上升,延长了气泡的运动路线,增加了气液的接触时间;3)搅拌使发酵液呈湍流运动,从而减少气泡周围液膜的厚度,减少液膜阻力,因而增大了KLa值;4)搅拌使菌体分散,避免结团,有利于固液传递中的接触面积的增加,使推动力均一,同时也减少了菌体表面液膜的厚度,有利于氧的传递。,2、空气的线速度 当增加通风量时,空气的线速度也就相应地增大,从而增加了溶氧,氧传递系数Kla相应地也增大。当然过大的空气线速度会使搅拌桨叶不能打散空气,气流形成大气泡在轴的周围逸出,使搅拌效率和溶氧速率都大大降低。 3、空气分布管 空气分布管的型式、喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较打影响。,4、培养液的性质 在
19、发酵过程中,由于微生物的生命活动,分解并利用培养液中的基质,大量繁殖菌体,积累代谢产物等都引起培养液的性质改变。 5、表面活性剂 培养液中消泡用的油脂等具有亲水端和疏水端的表面活性物质分布在气液界面,增大了传递的阻力,使氧传递系数Kla降低。,需氧的控制: 在一定的供氧能力下能控制需氧量,既做到满足生产菌的生长和产物合成对氧的需要,又不超过设备的供氧能力,使生产菌在这一条件下发挥最大的生产能力。 控制办法:如控制补料速度、温度的调节,中间补水,控制菌体浓度。,第八节 补料的作用及其控制 一、补料分批培养作用 补料分批培养(FBC)对微生物发酵有下列几个基本作用: 1、可以控制抑制性底物的浓度
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