DNA的生物合成和损伤修复-精选文档.ppt
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1、DNA生物合成,校正复制中可能出现的错误,并修复受到损伤的DNA,细胞中酶促修复系统,自然界DNA重组和基因转移的基本方式,基因组复制的主要特点 The General features of Genome Replication,第一节,一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和,含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质,称为基因组(genome)。在真核生物体中,基因组是指一套完整单倍体DNA(染色体DNA)和线粒体DNA的全部序列,既包括编码序列,也包括非编码序列。,二、基因组DNA复制具备一些共同特征,(一)基因组DNA都具有固定的复制起始点 (二)复制过程中形成复制泡和复制叉 (三)复制
2、的基本单位称为复制子 (四)半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 (五)半不连续复制克服了DNA空间结构对DNA 新链合 成的制约 (六)复制起点由多个短重复序列组成 (七)DNA复制必须有引物,复制起点(origin):指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。,(一)基因组DNA都具有固定的复制起始点,双螺旋DNA复制时,复制区生长点的结构呈Y形或叉形,称之为复制叉。,(二)复制过程中形成复制泡和复制叉,目 录,从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域,它是一个独立复制单位,包括复制起点和终点。,复制子(replicon),(三)复制的基本单位称为复制子,(四)半保留复制方式保证遗传信息的
3、忠实传递,(1)全保留式(conservative),即恢复原来的DNA双螺旋,并产生一个新的子代DNA双螺旋; (2)半保留式(semiconservative),即新老搭配,由一条新合成的DNA链和一条复制模板链配对产生子代双螺旋DNA; (3)散布式(dispersive),即复制模板链被分成许多小片段,散布于子代DNA中。,两条新合成的DNA链和两条原来的复制模板链之间的结合方式可能性:,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制方式,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,前导链(leading strand): DNA复制时,一条链的合成方向和复制叉前进方向相同,可以连续复制
4、合成的新链。 后随链(lagging strand):另一条链的合成方向与复制叉前进方向相反,不能连续复制,只能分成若干小片段分别合成,然后连接起来形成新链。后随链中的小片段称为冈崎片段(Okazaki fragments)。,(五)半不连续复制克服了DNA空间结构 对DNA新链合成的制约,前导链连续复制而后随链不连续复制,即DNA半不连续复制。,复制起点的一般特征: 由多个独特的短重复序列组成。 短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。 一般富含AT,利于双螺旋DNA解旋,以产生单链DNA复制模板。,(六)复制起点由多个短重复序列组成,E.coli 复制起始点 oriC,酵母复制起点为
5、自主复制序列(autonomously replicating sequences,ARS):,酵母染色体含有多个复制起点。,元件A(富含A/T的共有序列):结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)。 3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率,其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。,酵母复制起始点,DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链,必须由引物(primer)提供自由的3-OH末端,通过加入核苷酸使之不断延伸。 所有细胞和多数病毒的DNA复制,首先利用模板合成一段RNA引物,这一过程为引发(priming)。 RNA引物5端的第一个核苷酸通常是pppA
6、(个别为pppG)。,(七)DNA复制必须有引物,1.多数DNA复制使用RNA引物,174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3-OH为引物; 腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒DNA的5端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的3-OH为引物开始复制。,2.个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物,三、不同基因组DNA通过不同的模式 进行复制,(一)真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录 (二)基因组单链DNA通过复制中间体完成复制 (三)有的基因组DNA通过RNA中间体进行复制 (四)双链环状DNA也有不同的复制方式,四、不同基因组RNA通过不同的 模式进行复制,(一)基因组双链RNA复
7、制过程是双链复制 (二)基因组单链正链RNA以负链为模板进 行复制 (三)基因组单链负链RNA以正链RNA为模板进行复制 (四)反转录病毒的基因组RNA通过DNA中间体进行复制,DNA复制过程 Process of DNA Replication,第二节,一、原核生物DNA复制体现了复制的基本过程和特征,(一)在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物 1. E.coli复制起始需要6种蛋白质因子 2. 解螺旋酶激活引发酶形成引发体 3. 解旋还需要促旋酶和SSB,DnaA、DnaB、DnaC、HU、 促旋酶(gyrase,即拓扑异构酶)、 单链DNA结合蛋白(single strand bindi
8、ng protein, SSB),DNA复制需要6种蛋白因子:,E.coli DNA复制起始,结合oriC的4个9bp反向重复序列形成复制起始复合物。 作用于oriC的3个13bp正向重复序列,DNA在这3个位点解链,形成开放型复合物(open complex)。,DnaA蛋白,53解旋酶作用产生两条复制模板链 激活引发酶DnaG蛋白 DnaB蛋白与引发酶结合,形成引发体,DnaB蛋白,使一条DNA链围绕着另一条旋转,消除解旋产生的张力。,促旋酶,SSB蛋白,HU蛋白,稳定解旋后的单链DNA构象,有助于解旋。,DNA结合蛋白,对复制起促进作用。 HU蛋白能够使DNA发生折叠。,E.coli 中
9、DnaB结合引发酶DnaG,催化合成RNA引物,其序列始于pppAG,模板链序列3-GTC-5,引物长度一般1112个碱基。,(二)引发酶合成RNA引物,负责切除RNA引物。,(三)复制时聚合酶催化DNA合成而 聚合酶切除引物,DNA聚合酶,可利用损伤尚未修复的DNA链作为模板合成DNA,但不能修复损伤。,负责合成DNA。,DNA聚合酶,DNA聚合酶,原核、真核细胞DNA聚合酶的类型和功能,目 录,个核心酶 1个-复合物(、 6种亚基) 可滑动的DNA夹子(含1对-亚基),DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括:,亚基(130 000)主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性(校正功能)亚基可
10、增强其活性 亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成:,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用,其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动,分别负责合成前导链和后随链。,功能:-复合物是DNA夹子加载蛋白,负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基(DNA夹子)加载于DNA,使DNA聚合酶具有持续合成能力。,-复合物由6种亚基组成:、,在复制叉同时合成前导链和后随链,53外切酶:去除RNA引物 35外切酶:起校正作用 DNA聚合酶活性:填补两个冈崎片段之间的缺口,DNA聚合酶有3个酶促活性结构域:,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段:Klenow 片段,604个氨
11、基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Tus蛋白具有反解旋酶(contra-helicase)活性,识别并结合ter序列中共有序列,阻止Dna B蛋白的解旋作用,从而抑制复制叉前进。 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外,还可能造成复制体解体。,(四) Tus蛋白识别复制终点使复制终止,在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止区(ter D/A和ter C/B)。,当oriC处于半甲基化状态时,SeqA蛋白迅速结合半甲基化的GATC,阻止Dam甲基化酶与之结合,使复制起点不能被完全甲基化,同时阻止DnaA蛋白结合oriC。 oriC的GATC被完全甲基
12、化,DnaA蛋白就能与之结合,开始新的一轮复制。,(五) DNA甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用,E.coli复制起点oriC含有11个拷贝GATC,这一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位点。,在复制过程中,DNA每复制10bp,复制叉前方的模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周,产生正超螺旋。 拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合DNA分子上的磷酸基团,切断磷酸二酯键。,(六) DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶,消除正超螺旋,使复制叉能够顺利前进。 维持E.coli、噬菌体和质粒DNA复制起始模板DNA负超螺旋状态。 环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环。,
13、DNA拓扑异构酶功能:,E.coIi的Topo只作用于负超螺旋DNA,消除负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能:,E.coli的Topo将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能,E.coli 的Topo功能是将复制产生的两个子染色体从连环体中分离出来,催化连环和去连环过程 。,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等; DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换; 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,二、真核生物DNA复制和原核生物相似但更为复杂,真核生物与原核生物DNA复制的差异:,(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,A家族与大
14、肠杆菌Pol同源,包括Pol 和Pol B家族与大肠杆菌Pol 同源,包括Pol 、和 C家族与大肠杆菌Pol 同源,仅在真菌中发现 X家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性,却与末端转移酶同源,成员包括Pol 、 Y家族( UmuC/DinB超家族),近年发现一个特殊的真核及原核DNA聚合酶家族,成员包括Pol 、和Rev1,Pol 负责合成引物 Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复 Pol 的功能与Pol 相似(其确切功能尚待定) Pol 可能和碱基切除修复有关 Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复,常见的真核DNA聚合酶有5种:,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,(二)真
15、核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似,DNA聚合酶(Pol )分子含有4个亚基:,1. DNA聚合酶/引发酶复合物合成RNA-DNA引物,p180:催化亚基 p48:具有引发酶活性 p58:p48的稳定性和活性所必需的 p70:与组装引发体有关,功能:合成RNA引物 反应过程: 调节:磷酸化的调节作用,Pol /引发酶复合物,首先,合成RNA引物; 其次,利用DNA聚合酶活性将引物延伸,产生起始DNA(initiator DNA,iDNA)短序列,形成RNA-DNA引物; 最后,Pol /引发酶脱离模板链DNA,发生DNA聚合酶转换(switch)。,结构: p70、p34和p1
16、1组成异源三聚体 功能:,2. RPA的功能与E.coli的SSB相似,复制蛋白A(replication protein A,RPA),结合单链DNA 促使双螺旋DNA解旋 激活Pol /引发酶活性 为Pol 依赖复制因子C(RFC)和增殖细胞核抗原(PCNA)合成DNA所必需 RPA三聚体与SV40 T抗原结合,组装引发体复合物所必需 RPA参与DNA重组和修复,p140 结合PCNA p40、p37和p36组成稳定的核心复合物,具有依赖DNA的ATPase活性 p38可能在p140和核心复合物之间起连接作用,3. RFC与E.coli DNA聚合酶的-复合物功能相似,复制因子C(repl
17、ication factor C,RFC),结构:有p140,p40,p38,p37、p36 5个亚基,促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链,是Pol 在模板DNA链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。,RFC的功能:,PCNA是Pol 的进行性因子,使Pol 获得持续合成能力。 PCNA是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。 PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。 PCNA能激活Pol 。,4. PCNA是可滑动的DNA夹子,增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen,PCNA),结构:,功能:,同源三聚体
18、,可形成闭合环形的可滑动DNA夹子。,p125:催化亚基,具有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性,其N端区与PCNA相互作用 p50:辅助PCNA激活p125,5. DNA聚合酶合成前导链和后随链,结构:Pol 分子是异源二聚体(p125和p50),功能:Pol 合成前导链和后随链,DNA聚合酶,FEN1(flap endonuclease 1)具有核酸内切酶和53核酸外切酶活性。 FEN1参与去除冈崎片段5端的RNA引物。,6. FEN1和RNAse H切除RNA引物,RNAse H是核酸内切酶,参与冈崎片段成熟时切除5端RNA引物,底物RNA连接在DNA链的5端,切割后在DNA链的5端残
19、留一个核糖核苷酸,这个核苷酸再被FEN1切除。,DNA复制需要DNA解旋酶打开DNA双螺旋,使复制模板链得以暴露。,7. DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板,8. 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复合物,真核DNA复制叉模型,Pol /引发酶 合成RNA-DNA引物 Pol 合成前导链和后随链 RFC 识别引物iDNA的3端并驱除Pol /引发酶 PCNA 结合DNA并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段5端的RNA引物,真核生物复制过程中酶及功能,Pol (或Pol ) 填补冈崎片段之间的空隙 DNA连接酶 封口 RPA 稳定解旋后的单链DNA 解旋酶 复制叉的形成
20、和移动必不可少 拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力,(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换,识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后,Pol /引发酶复合物结合于复制起点,这一步叫做引发体组装。 引发体组装包括DNA解旋酶与Pol /引发酶相互作用。,1. 解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体,前导链:出现在引发后期 后随链:发生于每个冈崎片段合成之际 发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力 DNA聚合酶/转换的关键蛋白是RFC,2. DNA聚合酶/转换,真核DNA聚合酶转换和后随链合成,首先RNAse H利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段5端的RNA片段
21、,在RNA-DNA引物连接点旁留下1个核糖核苷酸; 然后FEN1利用53核酸外切酶活性切除这最后一个核糖核苷酸。,(四) 切除RNA引物有两种机制,解旋酶Dna2具有依赖DNA的ATPase和35解旋酶活性,其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5端引物形成“盖子”结构,再由FEN1的内切酶活性切除引物。,依赖RNAse H/FEN1切除方式:,依赖Dna2/FEN1切除方式:,切除RNA引物的两种机制,RNAse H/FEN1,Dna2/FEN1,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期,而且只能复制一次。,(五) 真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次,1. 前复制复合物在G1期形成而在
22、S期被激活,真核细胞DNA复制的起始分两步进行,即复制基因的选择和复制起点的激活。,复制基因(replicator)是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。,复制基因的选择出现于G1期,基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物(pre-replicative complex,pre-RC)。 复制起点的激活出现于细胞进入S期以后,这一阶段将激活pre-RC,募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶,并起始DNA解旋。,在原核细胞中,复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中,这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。,ORC至少募集两种解旋酶加载
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