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1、【案例】3 患儿,半岁,女。以突然发病出现发热、水样腹泻和呕吐等症状于2012年11月5日急诊入院,询问病史患儿为早产1个月,人工喂养,体检轻微脱水症,蛋花样粪便,体温38。患儿起病急,出现发热、水样腹泻和呕吐等症状,发病时间为深秋,体检轻微脱水征,蛋花样粪便。 【讨论题】你作为检验人员,如何进行采样并进行实验室检验确诊?,1. 案 例 分 析,2. 样品采集及前处理,3. 实 验 室 检 测,4. 预 期 结 果,案例分析,01,1、 急性水样便腹泻,多为轮状病毒或产毒素性细菌感染。小儿尤其是2岁以内婴幼儿,发病在冬秋季节,以轮状病毒肠炎可能性大;发生在夏季以产肠毒性大肠杆菌(ETEC)肠炎
2、可能性大。 2、根据患儿表现出的症状(发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪便)以及患病时间(深秋季节),高度怀疑为患儿感染了轮状病毒(rotavirus); 3、但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染,例如:致病性大肠杆菌(蛋花样粪便)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。 4、喂养不定时、不当或以淀粉食品为主食,或饮食脂肪过多以及断奶后突然改变事物品种,均能引起轻中度腹泻(消化不良)。气候突然变化,腹部受凉肠蠕动增加;天气过热,消化液分泌减少;由于口渴,乳脂过多,增加消化道负担,均易诱发腹泻。大便为稀薄或蛋花汤样,无脓血和酸臭味,如不及时控制,极易引发肠道感染。,案例分析,样本采集及前处理,02,4,3,2
3、,1,取30g奶粉于无菌采样袋中,密封,患儿血液:,患儿粪便:,奶瓶:,婴儿奶粉:,洁净棉拭子采样,采样杯采集婴儿新鲜粪便,0保存,普通真空采集管采集患儿足跟血;,5,6,接触物品:,接触人群的手:,洁净棉拭子采样,洁净棉拭子采样,实验室检测,03,Part 1,Part 2,Part 3,动态血常规检测 CRP值检测,细菌学检验,病毒学检查,在临床上可以通过动态血常规检测、CRP值检测来对两种疾病新生儿进行初步鉴别。 轮状病毒感染新生儿通常有发热及轻微消化道症状,易与严重细菌感染的新生儿混淆。从严重细菌感染新生儿的WBC、CRP检测结果来看,发病初始阶段(12h)的WBC、CRP水平与轮状病
4、毒感染新生儿无无显著差异,但发病24h后则显著高于轮状病毒新生儿。,轮状病毒:轮状病毒基因组由11个不连续的dsRNA节段组成,分别编码6个结构蛋白(VPIVP4,VP6和VP7)和5个非结构蛋白(NSP1一NSP5)。VP6是内层衣壳的主要成分,具有组和亚组抗原性,不同株轮状病毒VP6蛋白具有高度保守性。,检测方法的选择,01,real-time RT-PCR检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他4 种方法,可用于轮状病毒的高通量检测; ELISA和胶体金具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金成本低,非常适合于初筛检测。行业标准推荐的RT-PCR尽管特异性较高,但灵敏度偏低,有待改进,ELISA法诊断
5、效能优于胶体金法,胶体金法敏感、快速、单独样本可随时检测。 综上 本小组选用胶体金法作为初筛方法 real-time RT-PCR作为确诊方法,检测方法的选择,01,胶体金免疫层析法原理:以抗A组轮状病毒多克隆抗体包被硝酸纤维素膜、以胶体金标记的小鼠抗A组轮状病毒VP6单克隆抗体为结合物,利用免疫层析原理来检测粪便标本中的轮状病毒抗原。将试纸条插入用稀释液稀释好的标本中后,胶体金结合物与标本一起移动,当移动至硝酸纤维膜上的抗轮状病毒多抗时,如果标本中含有轮状病毒,则胶体金-轮状病毒结合物会与抗轮状病毒多抗结合,5-10分钟出现红色的检测线。多余胶体金结合物继续移动,将与包被在膜上的羊抗鼠IgG
6、抗体结合,形成另外一条红色的对照线。,胶体金免疫层析法原理,02,具体方法是提取适量的患者粪便放入到试管内,加入9倍的生理盐水后均匀搅拌,在静止后或者低速离心以后,在加样处另外滴加3-4滴粪便上清液,在室温情况下,10min以后进行辨别分析。如果测试卡显示的是两条红线,即可判断属于阳性,如果只仅仅出现一条对照线,则阴性,若没有出现对照线,说明检测结果无效,必须重新进行检测。,轮状病毒初筛,03,轮状病毒确诊,04,轮状病毒的确诊采用 real-time RT-PCR作为确诊方法。 方法原理:,取待测样品,加入匀浆缓冲液研磨,通过温育促进病毒粒子释 放,利用PEG8000使病毒沉降,采用纳米磁珠
7、直接从PEG8000沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子,吸 附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解,释放出病毒RNA,无需进一步纯化,直接实时荧光RT-PCR方法进行检测。,real-time RT-PCR检验流程图,荧光PCR结果的判定 1、对照结果 ) 阳性对照:有荧光增幅现象; ) 阴性对照:无荧光增幅现象; ) 空白对照:无荧光增幅现象; ) 否则,实验视为无效 2、检测结果判定 A、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常,待检样品无荧光增幅现象,则判断样品中未检出 群轮状病毒。 B、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常,待检样品有明显的荧光增幅曲线,且Ct值 35时,则判断样品中检出 群轮状病毒。 C、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常,待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时,应重新进行实时荧光RT-PCR 检测。若重新检测的Ct值40时,则判断样品中未检出A群轮状病毒。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间,则判断样品中检出A群轮状病毒,04,预期结果:该患儿为轮状病毒感染 确诊依据: 1、细菌培养未见可疑菌生长 2、WBC/CRP值未出现升高现象 3、实时荧光PCR确诊结果阳性,预期结果,
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