最新:2010年暑假中学骨干生物教师培训基因工程和细胞工程-文档资料-精选文档.ppt
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1、 生物材料 DNA mRNA 一定大小范围DNAPCR cDNA(互补DNA) 反转录 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 人工合成 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步 第二步 第三步 第四步 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 生物材料 PCR cDNA mRNA DNA 基因组文库 cDNA文库 一定大小范围DNA 人工合成 逆转录 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步第一步 第二步第二步 第三步第三步 第四步第四步 基因文库(gene library)概念 u
2、又称DNA文库,是指某个生物的基因组DNA 或cDNA片段与适当的载体在体外重组后,转 化宿主细胞,通过筛选后得到大量的阳性菌 落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即为 该生物的基因文库。 u基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞 组成。 mRNA 结构图 DNA 结构图 基因组文库(Genomic library) 将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内 切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA 片段,再与合适的载体在体外重组并转化相 应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库 以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组 的信息,可用于分离目的基因和保存某种生 物的全部基因。 基因组文库 c
3、DNA文库 (cDNA library) 提取某生物组织或发育时期的总mRNA,经反转 录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存 于受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA 文库。 cDNA(complementary DNA,互补DNA):是由生 物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA cDNAcDNA文库文库 反转录酶 cDNA 克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片段 ,或提取组织或器官的mRNA并反转录成
4、cDNA; 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA; 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌; 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为: 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库( 细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库) 。 基因组文库的质量标准 一个理想的基因组文库应具备下列条件: u重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力; u载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆; u克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆 排序; u克隆片段易于从载体分子上完整卸下;
5、 u重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 cDNA文库的主要优点 cDNA文库特别适用于某些RNA病毒的基因组结 构研究及有关基因的克隆分离; cDNA文库较小,易于筛选; cDNA文库可用于在细菌中表达真核生物的基因 ; cDNA文库结合基因组文库可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究。 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息远少于基因组DNA 文库,并且受细胞来源或发育时期的影响; cDNA文库不能直接获得基因内含子序列和基 因编码区外大量调控序列的结构与功能方面 信息; 在cDNA文库中,高丰度mRNA的cDNA克隆所占 的比例比较高,分离起来比较容易,而低丰 度mRNA的
6、cDNA克隆所占的比例则比较低,因 此分离也就比较困难。 从基因文库中筛选目的基因 1.通过克隆序列筛选:核酸杂交(探针)和PCR( 引物) 2.通过表达产物筛选:免疫学检测(抗原抗体反 应) 探针 探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片 段(大约是20到500bp), 用于检测与其互 补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针,通过放射 自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针 法,将探针核苷酸的侧链加以改造,探针杂 交后,其侧链可被带有荧光标记的抗体所识 别,从而显示出位置。 菌落原位杂交法(核酸杂交) 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上, 经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤
7、 膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选 出含有目的序列的菌落。 对应的菌斑或噬菌斑位置不变, 可以直接找出阳性菌落。 特点: PCR筛选法 利用合适的引物,以从初选出来的阳性 克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对 PCR产物的电泳分析,确定目的基因序列所 在克隆。 免疫筛选法 放射性抗体检测法 滤膜(固定抗体) + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因 组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很 小。因此,要想从庞大的基因组中分离某个特定 的未知基因非常困难,因此先把材料DNA分成若 干易于处理的片段,然后确定目标序列在哪一片 段,再进一步从该
8、片段寻找目标序列,事情就变 得容易了。 为什么要建 基因文库? PCR法获取目的基因 已知基因: 设计合成一对引物,直接从基因组DNA(或文库 )中扩增该目的基因。 未知基因: 参照其他物种中该基因的两末端设计引物,从基 因组DNA(或文库)中扩增该目的基因; 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物 ,扩增出一段DNA,标记为探针,从基因组文库 、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是:要有足够制备 合适引物的信息 PCR法获取目的基因优点 1.简便快速:在有足够引物信息的情况下,可直 接从基因组DNA中克隆目的基因,大大减少了基 因分离的工作量; 2.灵敏度高:可从极微
9、量的模板扩增出目的片段 ; 3.对起始材料质量要求低:由于其灵敏度高和特 异性强,极微量的材料或者混合的组织、部分已 降解的DNA材料都可以作为起始材料; 4.也可用于基因文库的构建。 化学合成制备目的基因 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 获取目的基因的方法 一般来说: 目的基因的获得通常采用PCR法;化学 合成法由于合成的片段较短,一般用于引物 和探针的合成;基因文库一般用于保存基因 资源。 目的基因检测与鉴定 通常采用分子杂交的方法。 分子杂交:采用已知标记的核酸分子或蛋白质分 子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交( DNA)、North
10、ern 杂交(RNA)和 Western 杂 交 (蛋白质)。 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与 DNA的二条单链之间进行,也可以在蛋白质 与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变 性以后,在复性的过程中两个不同来源的且 同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 蛋白质之间的杂交通过抗原抗体反应进行。 通常通过各种方法将核酸(蛋白质)分子固 定在固相支持物上,然后用放射性元素等标 记的探针(抗体)与被固定的分子杂交,经 显影(显色)后显示出目的核酸(蛋白质) 分子。 Southern杂交的操作步骤 (1) 酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA
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