动物肝脏DNA提取和鉴定-PPT文档资料.ppt
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1、1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法 。 3、学习核酸染色的方法。 一、实验目的: 二、实验原理: 要获得纯的DNA样品,必须考虑以下几点: 如何选材,如何破碎组织细胞? 如何除去蛋白质?(在真核细胞内,DNA与蛋白质结合成核蛋 白的形式存在。因此,分离DNA时必须使其与蛋白质解离,并除去蛋 白质。) 设法除去RNA的污染; 防止DNA酶的降解作用; (一)动物肝脏DNA制备原理 选 材 要提取动物组织DNA,一般选择细 胞膜较脆弱,容易破碎的动物脏器,如 胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。 研磨:将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石 英砂
2、研磨或匀浆,破碎细胞。这种方法温和,适合实验室使 用。 组织捣碎器:较剧烈的破碎细胞的方法,为了防止发热和升 温过高,通常是转10秒20秒,停10秒20秒,可反复多次 。 压榨法:在1000105Pa2000105Pa 的高压下使几十毫升 的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎 。温和的、彻底破碎细胞的方法,但仪器费用较高。 细胞破碎方法机械物理法: 反复冻融法:将待破碎的细胞冷至15到20 ,然后放于室温(或40)迅速融化,由于细胞内形 成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破 碎。 超声波处理法:借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。使用时注意降温,防止过热。 冷热交替
3、法:在90左右维持数分钟,立即放入冰 浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以 被破碎。 细胞破碎方法机械物理法 有机溶剂处理法:利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或 SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞, 可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与 研磨法联合使用。 溶胀法:细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低 浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子 大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 细胞破碎方法化学方法 (三)除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl(1-2molL)溶液中 溶解度很大,但在0.14molL NaCl溶液中溶解度很低 ,而核糖核蛋白则溶于0.14
4、molL NaCl溶液中,利 用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋 白分离开来。 (四)除去蛋白质的方法 用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液,使蛋白质变性,然 后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿 相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95乙醇溶液可 将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,可以直接 从生物材料中提取DNA。 纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解,提取时可加入适量 EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸,以降低DNA 酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA,获得纯的DNA。 保存:将DNA于滤纸上干燥,溶于1ml
5、TE中低 温保存。 (二)琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理 : l琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电 泳分离方法,是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法,已 成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 l琼脂糖英文名agarose,是从琼脂中提取出来的,由半 乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖 和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶,电 泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少,电渗 作用降低,因而分离效果明显提高。 lDNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场 中向正极移动(电荷效应) 。 lDNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带
6、电量有关 外,还与DNA分子的大小和空间构象有关(琼脂糖凝胶 的分子筛效应)。 l电泳时,用溴酚蓝做前沿指示剂,用溴化乙啶 ( ethidium bromide,EB) 指示DNA样品在凝胶中的确 切位置。 l溴化乙啶是一种荧光染料,可插入DNA双螺旋结构的 两个碱基对之间,与DNA分子形成络合物,在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。 l 荧光来自两方面,一是核酸吸收260nm的紫外光,并 将能量传给EB;二是EB本身吸收波长为302nm和 360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出 波长为590nm的红橙色荧光。 l 溴化乙啶可加入凝胶中,也可以在电泳后,将凝胶 放在含EB的溶液中浸
7、泡. l 溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高,可检出10ng甚至 更少的DNA。 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素 (1)核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中,DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比( 20kb) ,因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较,便可测出未知片段的大小。 (2)核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为:闭环DNA直线DNA开环的双链 环状DNA. (3)不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳 分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/
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