最新:植物细胞工程课件第一章实验室基本技术-文档资料.ppt
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1、实验室设置 基本技术 培养基及其配制 细胞培养环境控制 外植体接种培养,主要内容,1.1 实 验 室 设 置,实验室组成 基本设备配置 培养容器与用具,细胞工程实验室的基本要求,实验室布局示意图,基 本 实 验 室,准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮,通风条件好。,培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度,其次为防止微生物感染,培养室应保持干燥和清洁。,接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保持无菌。为了保持清洁,接种室应防止空气对流。,辅 助 实 验 室,细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细
2、胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥,使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。,生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验实验室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。,基本设备配置,基本设备,灭菌设备,光照培养室与设备,无菌操作设备,细胞学鉴定设备,培养容器与用具,1.2 基本技术,洗涤技术 灭菌技术,洗 涤 剂,合成洗涤剂,铬酸洗涤液,常用的铬酸洗涤液配方,玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿、已使用过的试管、烧杯、三角瓶 、吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品。 塑料用品洗涤 一般用合成洗
3、涤剂洗涤,因其附着力较强,因此冲洗时必须反复多次,最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤, 需要清洗时,一般用酒精擦洗,然后火焰干燥。,培养基 湿热灭菌,即高压高温蒸汽灭菌。 玻璃器皿 湿热灭菌或干热灭菌,即在烘箱中加热至15040min,或1202h。 金属器皿 干热灭菌。 接种室 接种室常采用定期熏蒸,熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾,一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾。,培养基体积与灭菌时间的关系,1.3 培养基及其配制,植物细胞培养基及其配制 动物细胞培养基及其配制,植物细胞培养基及配制,培养基基本成分,培养基配方,培养基配制,无 机 盐 类,大量元素 培养基的大
4、量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S。 微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co。,有 机 成 分,糖 维生素 肌醇 氨基酸 其它,植 物 激 素,生长素,细胞分裂素,其它,其它附加成分,琼脂 活性炭 附加复合成分,常用培养基配方,常用培养基配方: MS(Murashing and Skoog, 1962) White(White, 1934) B5 (Gambor et al, 1968) N6 (朱至青,1974),培 养 基 配 制,大量元素配制成10-
5、20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 激素单独配制成mg/ml的母液 培养用培养基按需要按比例加入,动物细胞培养基及配制,动物细胞培养的营养需求特点 培养基配方及培养基选择 培养基配制,动物细胞培养液的成分及性质,氨基酸类 (1)必需氨基酸 Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Cys、Ser等 (2)非必需氨基酸 维生素类 盐类 葡萄糖 缓冲系统 大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。HEPEs现被广泛使用,常用浓度为25mmol/L。,矿物类 有机补充物 如核苷类、TCA中间产物、丙酮酸盐、类脂化合物等。 激素类 如insulin、生长激素、氢化可的松等。 生长因子类 如
6、血小板衍生出来的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮生长因子及增殖刺激活性因子(MsA)等。,培养基配方及培养基选择,平衡液溶液(BSS) 天然培养液 合成培养液 无血清培养基 其他常用液,表1 几种常用的BSS (g/L),天然培养液,血浆 血清 胚胎浸出液 鼠尾胶原,合成培养液,人工方法模拟合成 如TC199、MEM、RPM-1640、DMEM、Hams F12等。 主要成分是氨基酸、vitamin、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质等。,无血清培养基,包括基础培养基和附加成分。 基础培养基:一般用人工合成的培养液,常用Ham F12和DMEM
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