最新:流式细胞仪分析技术及应用-文档资料.ppt
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1、FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,什么是流式细胞术(FCM)?,特点: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用,一 工作原理: FCM是一种在计算机技术支持下的高度 自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。,第一节 流式细胞仪的分析及分选原理,1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统,(一) 基本组成构,Injecto
2、r Tip,荧光信号,激光束,Sheath fluid,样品流和鞘流,1、液流系统,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,Flow cell,激光、透镜组、光电倍增等。,2、光学系统,(二) 基本工作原理,单细胞流:流动室,单细胞照明:激光,488 nm laser,488 nm laser,单细胞检测:信号处理,(一)前向散射光 (foword scatter):FSC 信号的强弱与细胞的大小相关 (二)侧向散射光(side scatter):SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关,二 散射光的测定,
3、Forward Angle Light Scatter,细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,90 Degree Light Scatter,细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.,前向散色光FSC,侧向散色光SSC,利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群,淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。,散射光的测定,荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 (一)光信号测量 线性放大器 对数放大器,三 荧光测量,Ethidium,PE,cis-Parinaric acid,Texas Red,PE-TR Conj.,PI,FITC,Common Laser Lines,DNA,Excita
4、tion,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,(二)荧光补偿,利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”,(一)分选的基本原理,488 nm laser,-,Charged Plates,Single cells sorted into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,四 细胞分选原理,阳性选择,MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离,阴性选择,1 、分选速度:几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获
5、率:90-95% 4 、分选得率,(二)分选的技术要求,分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比。,第二节 数据的显示和分析,一、参数 前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少,二、数据的显示方式,(一) 单参数直方图,(二) 双参数显示,(三) 三参数显示,以分布直方图( distribution histogram ) 来显示,横轴为该参数测量强度相对值,单位是 道数。强度分布可以是线性的,也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细
6、胞出现的频数。,(一) 单参数直方图的显示,Single-Parameter Histogram Displays,X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.,(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays,细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞 数量的关系,更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系,其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上,横轴代表第一个测量参数,纵轴代表第二个测量参数。,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞,1 、点图,用等高线来表
7、示细胞数,在一条等高线上细胞数相 同,不同的等高线上细胞数不同。,2 、二维等高图,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。,3 、假三维等高图,三维坐标匀为参数(散射光或荧光)而非细胞数。,(三) 三参数直方图,一般利用所得参数的两两组合并利用设门(Gate) 技术,来分析参数之间的相互关系。,(四)流式细胞仪的多参数分析,1 、Region设置,2 、 设置,Gate,样品制备:单细胞悬液 特定荧光染料的选择:光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 质量控制,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂,一、免疫检测样品制备,淋巴细胞分离液
8、分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd,高密度,低渗透压,无毒性。 (比重为1.01770.001的分层液).,(一)外周血淋巴细胞样品的制备,利用红细胞裂解液去除红细胞后,得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图,单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来,然后离心漂洗。 悬浮培养细胞,可不用酶消化,直接吹打制备 成单细胞悬液。,(二) 培养细胞的样品制备,机械法:剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法:胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法:EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法: Triton-100、皂素等。,(三)新鲜实体组织单细
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