最新Akt1基因沉默降低小鼠乳腺癌细胞肺转移能力-PPT文档.ppt
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1、立项依据,Akt1是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,可通过磷脂酰肌醇激酶(PI3K)依赖的机制被胞外信号激活。目前发现Akt有三个家族成员Akt1PKB、AktPKB、AktPKB。它们的氨基端含有个血小板白细胞激酶底物同源结构区域(PH)可介导脂质蛋白质和(或)蛋白质蛋白质之间的相互作用。Akt通过区特异性与PI3K的类脂产物磷酯酰肌醇3,4,5-三磷酸结合募集到细胞膜上,并通过上游磷脂酰肌醇依赖性激酶1,2(PDK1、PDK2)磷酸化进入活化状态。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位,磷酸化大量的底物蛋白,最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。,近年来研究发现,Akt1不但影响肿
2、瘤细胞的增殖、凋亡,而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。Akt1基因在人胃癌中表达增加;活化的Akt1促进人类胰腺癌细胞、纤维肉瘤细胞和成纤维细胞的侵袭能力,但可抑制MDA-MB-2细胞的迁移能力。在乳腺癌中也发现Akt1异常表达和活性改变,并在乳腺癌的转移过程中发挥重要的作用。降低Akt1水平抑制Erb-2介导的乳腺癌体内转移;而过表达myr-Akt1可抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。Akt1活化还可促进Erb-2介导的乳腺肿瘤发生但抑制其侵袭能力。这些结果表明,Akt1在不同的细胞型或肿瘤的不同发展阶段所起的作用也不同。,研究目标和内容,作为一种原癌基因,Akt1在许多人类肿瘤中表达显著
3、增高,促进肿瘤转移;但也有研究表明, Akt1的活化可抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了深入探讨Akt1在肿瘤发生发展过程中的作用,采用RNA干扰技术沉默了高转移小鼠乳腺癌细胞4T1中Akt1的表达。MTT法检测发现,Akt1沉默不影响4T1细胞的增殖能力。Tr-answell法检测证明,Akt1沉默可降低4T1细胞的迁移能力。与以上结果相一致,Akt1沉默不影响乳腺癌形成原位瘤的能力,但显著降低其体内肺转移能力。结果表明,Akt1在小鼠乳腺癌细胞转移过程中发挥重要作用,并提示Akt1可能成为乳腺癌治疗的靶点。,计划和方案设计,一、细胞株与培养基 小鼠乳腺癌细胞株4T1 细胞培养用培养基为DME
4、-10培养基 培养环境为37培养箱,饱和湿度,5%CO2,0.25%的胰 -酶0.02EDTA消化传代细胞。 二、Akt1干扰载体的构建 慢病毒载体plko.1-puro质粒与已设计好的干扰序列 Akt1-1、Akt1-2和小鼠已知基因无同源性的DNA干扰序列为阴性对照(表1)合成的寡核苷酸退火形成双链DNA片断,克隆到U6启动子下游的EcoRI和AgeI酶切位点(EcoRI和AgeI酶切位点之间原先存在约1800bp的无关DNA片断),转入大肠杆菌DH5。EcoRI和AgeI双酶切筛选得到阳性克隆pLKO.1-siAkt1-,pLKO.1-siAkt1-1-2和pLKO.1-Control,
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