最新第二章细胞生物学研究方法-PPT文档.ppt
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1、,第一节 细胞生物学基本研究方法,(一)普通光学显微镜 (light microscope),1. 构成: 照明系统 光学放大系统 机械装置和支架 2. 原理:经物镜形成倒立实像,经目镜放大成虚像。,、显微镜技术,小鼠肾小管切片示线粒体,苏木精染色,3. 分辨力:指分辨物体最小间隔的能力。 显微镜的分辨力 R=0.61/NA 为入射光线波长; NA为镜口率 sin/2; n=介质折射率; =镜口角(样品对物镜镜口的张角) 普通光镜的最大分辨率是0.2微米。,不同光源的波长,不同介质的折射率,(二)荧光显微镜 (fluorescent microscope),特点:光源为短波光; 有两个特殊的滤
2、光片; 照明方式通常为落射式。,Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。研究组织和细胞特异蛋白等生物大分子分布、细胞内物质吸收和运输规律等,(三)相差显微镜 phase contrast microscope,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。 用途:观察未经染色的玻片标本。,(四)微分干涉差显微镜 differential interference contrast microscope (DIC),利用两组平面偏振光的干涉,加强影
3、像的明暗效果,能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。,(五)激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源,逐点、逐行、逐面快速扫描; 能显示细胞样品的立体结构; 分辨力是普通光学显微镜的3倍; 可分层扫描后三维重建,显示样品的立体图像。,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus
4、 (blue),(六)暗视野显微镜 dark field microscope,聚光镜中央有挡光片,视野背景是黑的,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,物体边缘是亮的。 可观察 4200nm的微粒子,分辨率比普通显微镜高50倍。,(七)偏光显微镜 polarizing microscope,用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器 (与起偏器方向垂直的偏振片)。 载物台可以旋转。,淀粉,(八)倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒; 用于观察培养的活细胞,通常具有相差或DIC物镜,有的还具有荧光装置
5、。,(九)现代光学显微镜的发展趋势,采用组合方式,集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体; 自动化与电子化。,二、电子显微镜,以电子束作光源,电磁场作透镜。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成; 分辨力0.2nm,放大倍数可达百万倍; 用于观察超微结构(小于0.2m)。,(一)透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM,由光路系统、真空系统和电路控制系统三个部分组成 光路系统由电子枪和电磁透镜系统(物镜、中间镜和投影镜)组成 真空系统用于保证电子束的高速运动。,TRANSMISSION EL
6、ECTRON MICROSCOPE,TEM,制样技术,1. 超薄切片 超薄切片厚度仅50nm左右,用超薄切片机制作。,2. 负染技术,用重金属盐(如磷钨酸) 染色;吸去染料干燥后,样品凹陷处铺了一层重金属盐,而凸的出地方没有染料沉积,从而出现负染效果,分辨力可达1.5nm左右。,Negative Stained Archaebacteria,3. 冰冻蚀刻 freeze-etching,亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。升温后,冰升华,暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉,把铂和碳的膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。,培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片,示 Clat
7、hrin衣被,(二)扫描电子显微镜 scanning electron microscope,20世纪60年代问世,用来观察标本表面结构 分辨力为310nm 用一束极细的电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子由探测器收集,信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步的扫描图像,Scanning electron microscope( SEM),人类红细胞,酵母,人类精子,(三)扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope,STM,根据隧道效应设计,非破坏性测量。 分辨率:横向为0.10.2nm,纵向可达0.01nm。 三态(固态、液态和
8、气态)物质均可进行观察。,(四)高压电子显微镜 high voltage electron microscope,(五)原子力显微镜 atomic force microscope,加速电压高,用于观察较厚的生物组织,三态(固态、液态和气态)物质均可进行观察 用于观察不导电的生物材料 活细胞表面、生物大分子空间伸展,三、显微操作技术 micromanipulation technique,是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史,1952 年,Briggs和King等将不同阶
9、段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵,构建核移植胚。Gordon(1962)证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年,Wilmut等克隆了绵羊Dolly。,显微操作仪,转基因显微操作过程,四、细胞的分离和分析技术,(一)、离心分离技术 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 悬浮液中的颗粒的沉降速度与其质量、密度、体积相关,还与悬浮介质的密度和黏度相关。,1. 差速离心法 Differential centrifugation,特点: 介质密度均一; 速度由低向高,逐级离心。 用途:分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序:核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细胞器初步分
10、离,常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,Low speed,High speed,Differential centrifugation,2. 移动区带离心法 moving-zone centrifugation,用于体积差别较小的颗粒的分离 制备有密度梯度的离心介质。介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,3. 等密度离心法 isodensity centrifugation,用途:分离密度不等的颗粒。 特点: 介质密度高,陡度大,介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10100倍,需要高速或超速离心。 原理:样品各成分在连续梯度的介质中经过一定
11、时间的离心沉降到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的成分分离。,(二)、流式细胞技术 flow cytometry,用途:对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理:包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞的液滴,在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群,分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计(flow cytometer)。,(三)、激光捕获显微切割技术 laser capture microdissection,在
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