最新第十二章动物细胞培养技术-PPT文档.ppt
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1、动物细胞与组织培养:指的是从动物组织或细胞从体内取 出,在模拟体内生理环境,无菌、适当温度和一定营养 条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养: 培养物是单个细胞和细胞群。 第一节第一节 体外培养动物细胞的生物学特性体外培养动物细胞的生物学特性 一、体外培养物的细胞生物学特点 (一)动物细胞特点 动物细胞大,无细胞壁 动物细胞生长缓慢,倍增时间长,易受污染 需氧量少,对机械搅拌或剪切力敏感 动物细胞间主要以聚集体形式存在 原代细胞一般繁殖50代即退化死亡 培养细胞最多见的表现是: 失去原有组织结构和细胞形态; 分化减弱或不显、出现类似“反祖” 现象; 表现为细胞趋单一化,或获
2、得不死性,或变成具有恶性 性状的细胞群。 (二)(二)体内外细胞的差异体内外细胞的差异 二、体外培养细胞的形态二、体外培养细胞的形态 (一)体外培养细胞的分类 体外细胞 生长 贴附型贴附型 悬浮型悬浮型 多形型细胞(神经元和神经胶质细胞,呈多角 形) 上皮细胞型(上皮、肝、胰和肺泡上皮等,源 于外胚层和内胚层细胞) 成纤维细胞型(心肌、平滑肌、血管内皮等, 源于中胚层细胞) 游走细胞型(单核细胞、巨噬细胞和某些肿瘤 细胞,形状不定) (生长时不贴壁,如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤 细胞) (二) 培养细胞的生长特点 体外细胞 生长特点 贴壁 接触抑制 密度抑制 1)细胞贴壁过程 2)接触抑制 定
3、义:细胞从接种到长满底 物表面后,由于细胞繁殖数 量增多相互接触后,不再增 加。 3)密度抑制 细胞接触汇合成片后,虽发生接触抑制 ,但只要营养充分,细胞仍然能够进行 增殖分裂,数量仍在增多,但当细胞密 度进一步增大时,培养液中营养成分的 减少,细胞营养的枯竭和代谢物的影响 ,则发生密度抑制,导致细胞分裂停止 。 三、培养细胞的增殖能力三、培养细胞的增殖能力 (一)培养细胞生命期(一)培养细胞生命期 细胞周期可分为G1期、S期、G2期 和M期。培养细胞单个细胞的生长 过程与体内细胞单个细胞的生长 过程相似。 体外培养细胞的生长增殖过程体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期:从体内取出组织接种培
4、养到第一次传代培养这个阶段, 一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃,有细胞分裂,但不旺盛细胞比较活跃,有细胞分裂,但不旺盛。 传代期:原代培养的细胞一经传代后便称细胞系细胞系。细胞增殖旺盛,当 传代10-50次后,细胞增殖缓慢,以致完全停止。 衰退期:细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强,最后衰退凋亡。 1.1.原代培养原代培养(Primary CulturePrimary Culture)期期: 也称初代培养初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传 代阶段,一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细 胞分裂,但不旺盛。 细胞群是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同,细 胞相互依存性强
5、。 由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药 物很好的实验对象。 2 2传代期传代期 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下,细细 胞增殖旺盛胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质, 细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10 50次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第 三期。 3 3衰退期衰退期: 此期细胞仍然生存,增殖很慢或不增殖,最后衰退凋亡。 由于某种因素的影响,细胞可能发生自发转化。细胞可能获得 永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增 殖能力,这
6、样的细胞群体称无限细胞系,也称连续细胞系。核 型大多变成异倍体。 (二)每代细胞的生长过程 细胞培养过程中一代一代指的是 从细胞接种到分离再培养细胞接种到分离再培养的 一段时间。在细胞一代中细 胞倍增36次。 时期:潜伏期;对数生长期;潜伏期;对数生长期; 稳定(停滞)期;衰亡期。稳定(停滞)期;衰亡期。 每代细胞生长曲线 每代细胞生长过程每代细胞生长过程 潜伏期 指数生 长期 停滞期 细胞接种后,先进入生长缓慢的滞留阶段 ,胞体均呈圆球形悬浮于培养液中,接着 细胞开始附着于支持物表面。细胞贴壁后 ,逐渐伸展,恢复细胞原有形态,经过一 个潜伏期,才进入生长和增殖期。 又称对数期。此期为细胞增殖
7、最旺盛的阶 段,细胞分裂相增多,成倍增长,活力最 佳。 又称平台期,此时细胞数量饱和,细胞不 再增殖,但仍有代谢活动。 细胞培养的一般过程:取材、培养及细胞 冻存与复苏。 第二节 动物细胞体外培养技术第二节 动物细胞体外培养技术 一、细胞的基本培养技术 (一) 原代培养 原代培养是将动物的各种组织从机体取出,经酶(常用胰 蛋白酶) 或机械方法处理,分散成单细胞,置培养基中培 养,使细胞生存、生长和繁殖。 鼠胚组织取材 1. 原代细胞的取材 鼠肾(或肺)取材 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料, 最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心 后由于各种细胞的比重不同
8、可在分层液中形成不同层,这 样可根据需要收获目的细胞。 1)悬浮细胞的分离方法 2. 原代细胞的分离 消化分离法 2)实体组织材料的分离方法 机械分散法 (物理裂解) 方法 特点:简便、快速, 但对组织机械损伤 大,而且细胞分散 效果差,适用于处 理纤维成分少的软 组织。 机械分散法 胰蛋白酶分散原理:主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞 间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。 酶消化分离法 胰蛋白酶 胶原酶 胰蛋白酶 消化分离法 1)组织块培养法 3.3.原代细胞的培养方法原代细胞的培养方法 2)分散细胞培养法 对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、 胸水和腹水中的癌细胞
9、和免疫细胞无需消化,可采用低速离心 分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 3)悬浮细胞培养法 (二) 传代培养 贴壁生长的细胞 消化法传代 直接吹打或用硅胶软刮 悬浮细胞 直接吹打 自然沉降法 传代培养方法 (1) 贴壁细胞的消化传代方法 (2) 悬浮细胞传代方法 直接传代 让悬浮细胞自然沉降 弃掉1/2-1/3上清 用吸管轻轻吹打制备成细胞悬液 分装培养 离心法传代 将培养液转移到离心管中 离心收集细胞 弃去上清 加新的培养液吸管吹 打制备成细胞悬液 分装培养 体外培养的细胞源于人或动物的胚胎组织,体内的细胞都 是混杂生长,来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传 代细胞绝大多数
10、都呈混合生长,既有上皮样细胞又有纤维上皮样细胞又有纤维 样细胞样细胞,混杂的细胞会直接影响实验结果。 (三)细胞纯化(三)细胞纯化 1.1.自然纯化自然纯化 自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势利用某一种类细胞的增殖优势,在长期传代过程中 靠自然淘汰法,不断排挤其他生长慢的细胞,靠自然增殖的潜 力,最后留下生长优势旺盛的细胞最后留下生长优势旺盛的细胞,达到细胞纯化的目的。 但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时 间长,留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞肿瘤细胞或突变的细胞可 以通过此方法而保留下来的,不断纯化而建立细胞系。 2.2.人工纯化人
11、工纯化 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件对某一细胞生长有利的环境条件 ,抑制其他细胞的生长,抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 (1)酶消化法 酶消化法是比较常用的纯化方法,对贴壁细胞可行,能利用上皮细胞和 成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,成纤维细胞先脱壁。 (2)机械刮除法 原代培养时,如果上皮细胞和成纤维细胞分为区成混杂生长 ,每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可 用硅橡胶刮子去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域 。这样反复多次可以纯化细胞。 (3)反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程
12、快成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程快,大部分细胞能在 短时间内(大约10-30min)完成附着过程。上皮细胞(大部分 )在短时间内不能附着或附着不稳定,稍加振荡即浮起,利用 此差别可以纯化细胞。 (四)细胞的冻存(四)细胞的冻存和和复苏复苏 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费,减少污染,减少细胞遗 传性状的改变和延缓衰老。 目前,动物细胞一般保存于液氮中(-196)。 一般在原代或传代原代或传代2-102-10次次内即大量 冻存,作为原种。 在细胞冻存时加入冷冻保护剂,可以保护细胞免受冷冻损伤。原理: 1.常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细 胞,降低细
13、胞的冰点。 2.提高胞膜对水的通透性,促进细胞内水渗出细胞外,减少细胞内冰晶 的形成,从而减少冰晶对细胞的损伤。 冷冻保护剂的应用冷冻保护剂的应用 冻存和复苏的原则:慢冻快融冻存和复苏的原则:慢冻快融 当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水, 细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反, 结晶很大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快复苏过程应快 融,目的是防止小冰晶形成大冰晶融,目的是防止小冰晶形成大冰晶。 慢冻程序 标准程序: 当温度在-25以上时, 12/min 当温度达-25以下时, 510/m
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