2010Nov12细胞衰老分子机理研究进展.ppt
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1、1,生命科学永恒的主题,“衰老”老年病 百病之源。 老年病 发病率 老年性痴呆(AD) 65岁老人1/20 85岁以上老人 人一生中医疗费 2/3用于晚年 ?,健康、长寿,2000年(第五次)我国人口普查 65岁 老人=总人口10% 约1.2亿 65岁以上人口: 714 法国需114年 中国需 27年 (美国人口局,U.S. Census Bureau预测),2,因老而衰: 预防老年病 造福个人与家庭 节约社会财富 解放生产力 弄清衰老机理,可有的放矢,提出因应举措, 提高延衰效能。,老年病种类繁多(老年性痴呆,帕金森病等神经退行性疾病,老年 糖尿病、骨质疏松、心、脑血管、呼吸等系统疾患,以及
2、肿瘤) 表现有别 发病各异,3,发达国家近年意识到衰老与老年病的研究可望收益和回报,纷纷改变理念,从福利观点,转到经济视角,既看到社会需求,也看到无限商机,加强研究投入。 仅仅美国国会批准2005年度美国立衰老研究所(老年医学基础研究为主),一个所的预算,达10亿5千万美元。,4,如今,全球生命科学研究最热的三个领域是: 衰老、肥胖和癌症,衰老在其中独占鳌头。 人类对衰老的探究几乎从封建社会建立以来,就有所记载,然而,真正进入科学研究衰老的范畴,还是近20年的事。 现在,国内外科学家对衰老的研究主要集中在哪些方面?从哪些角度进行研究?科学家都取得了怎样的成就? 生命世界衰老的科学研究策划案 0
3、3 30, 2006 生命世界中国科学院主管,中国科学院植物研究所、中国植物学会和高等教育出版社联合主办,5,人为什么会衰老?,6,统计资料表明:子女的寿命常与双亲的寿命有关; 各种动物的最高寿限相当恒定。 衰老进程由环境(外因)与遗传(内因) 两大因素决定,7,1992年世界卫生组织 人的寿命决定因素 遗传因素 15% 社会经济因素 10% 医疗服务技术 8% 气候因素 7% 生活习惯、卫生行为、精神面貌、保健意识等 60%,?The results of human twin studies suggest that only 20-30% of the variation in surv
4、ival to an age of about 85 years is determined by genetics A. M. Herskind et al., Hum Genet 97, 319 , 1996,8,平均寿命主要与环境相关;物种最高寿限与遗传相关。 不良环境可作用于遗传物质或其产物 影响衰老进程。 段建明等 (Duan JM, et al.) Intl J Biochem Cell Biol 37 (2005) 14071420 (基因对寿命的影响),线虫(C. elegans )研究首次严格证明:单基因突变即可影响寿命。 clk 基因与daf-2基因双突变,线虫寿命延长5倍
5、。 基因对衰老进程的主导性,9,人类“长寿基因的探索 Puca, AA ( Childrens Hosp )与Perls, Thomas( Boston Univ )等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001)报道: 分析137组 (308人)长寿同胞,百岁老人血样 发现:四号染色体 D4S1564 (D代表DNA, D后的数字表示染色体号,s代表节段segment,s后的数字表示微卫星在染色体上的编号) 位点与众不同,可能含有“长寿基因”。 Perls: 一年以后见分晓 ?,10,Sebastiani P, et al. Genetic Signatures of
6、Exceptional Longevity in Humans. 老寿星的遗传特征 Science 2010 Jul 21. Epub 1055( centenarians):1267 (controls) 分析结果:建立了以150 SNPs (single-nucleotide polymorphisms)为基础的 分类模型。 该模型用于另一组(百岁老人及其对照):正确率 77% 。 芯片分析显示: 按差异SNP(或遗传特征 )不同组合,可将90%的百岁老人分成19个群体。一种组合可能与某一老年病(e.g., dementia, hypertension, and cardiovascula
7、r disease)易感性有关,或可由此将健康老人的表型分成不同亚型。 新英格兰百岁老人研究中心(New England Centenarian Study),11,老年医学基础是人口老龄化需求的前沿学科 进行人类的衰老实验性研究,耗时费力,困难重重。 用动物实验研究衰老,由于人与动物差别大,实验结果,只能借鉴,不能 照搬。与细胞模型相互配合,可补动物实验之不足。,衰老的实验性研究成果累累,12,细胞 生物的基本构成单位 细胞衰老 老年病发病的共同基础 人成纤维细胞(人胚细胞可传60-70代,50岁成人细胞只能传1020代) 在体外培养可传代数,与供体年龄有关。 供体年龄越大,传代越少。 细胞
8、衰老是个体衰老的微观模型,可部分体现个体衰老。 理想状态:人类细胞衰老模型与动物实验相辅相成 细胞衰老模型有非整体性与非生理性的局限性。 如与动物整体实验相配合,可取长补短,相辅相成。,13,细胞衰老 (Cell Senescence) 生物衰老的基本单位 老年病发病的共同基础,细胞衰老老年退行性变功能衰退 增殖能力下降细胞数减少脏器萎缩 细胞衰老是造成个体衰老的主要原因之一。,14,体外培养人类细胞衰老模型在研究人类衰老方面,具有不可取代的优点: 无模式动物存在种族差异的缺点 无人体实验取材难,操作难,周期长等缺点 M. Kuro-o (Texas大学) “Cell senescence h
9、as been suggested to be directly related to senescence of living organism, including humans.” Cellular & Molecular Life Sciences 57(2000):695-697,15,衰老机制复杂,单一的衰老相关指标难以准 确、特异地评估衰老程度。,组建一套定量的细胞衰老生物学年龄指征,准确定量细胞衰老程度,可,1、研究各种因素对衰老进程的影响 2、检验药物抗衰作用,为中药现代化提供技术 支撑。,细胞衰老程度如何评估?,16,分子水平 细胞衰老指征 端粒长度 细胞体外增殖能力 晚期
10、糖基化终末产物 衰老相关-半乳糖苷酶活性 DNA损伤修复能力 DNA甲基化程度 线粒体DNA片段缺失,17,我国端粒与人类细胞衰老相关性的研究,端粒长度: 人类体细胞的计时器。每增加1代龄,端粒长度减少约49 bp。,中国人外周血淋巴细胞的端粒长度每年平均缩短35 bp。 (张宗玉等,生物化学杂志,1995),Southern blots,Telomere lengths,+,细胞越老,端粒越短, 电泳时跑得越快,18,人胚成纤维细胞体外培养代龄与细胞增殖速度的关系,细胞的体外增殖能力 广泛应用于衰老研究。,Growth curves MTT assay,19,人胚肺二倍体成纤维细胞(绿色者为
11、衰老细胞),衰老相关半乳糖苷酶活性,衰老细胞,年轻细胞,SA-gal staining,20, DNA损伤修复能力 随增龄而下降,损伤前 损 伤 修 复,年轻细胞,衰老细胞,损伤前 损 伤 修 复,comet assay 彗星试验 (单细胞凝胶电泳),尾长(m) ;尾面积/总面积(%) 尾越长,%越高,损伤越重,21,晚期糖基化终末产物 蛋白质糖基化与大分子交联,逐渐脱水,形成的一种具有黄棕色荧光的产物。,Determination of AGE (Advanced Glycation End product),22,从分子水平组建一套 为国际所承认的 细胞衰老生物学指征。,我室在国外刊物的部
12、分相关论文: Duan JM, Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37:1407-1420 Zheng WJ, et al. J Biol Chem 2004,279:31524-31532 Guo SZ, et al. Exp Cell Res 2004,298:465-472 Huang Y, et al. J Cell Physiol, 2004, 201: 483-491. Zhang XW, et al. Oncogene 2003, 22 : 2405-2416 Wang PC, et al. Mech Age Dev 2003,124: 1025-10
13、34 Duan JM, et al. J Biol Chem 2001 276: 48325-48331. Li JH, et al. Mech Age Dev 1995,80:25-34. Tang ZQ , et al. Mech Age Dev 1994,73:57-67.,基因水平 细胞衰老指征?,23,1.5% 1.0% 0.5% -0.5% -1.0% -1.5%,2.0倍 2.5倍 3.0倍,用cDNA芯片检测人二倍体成纤维细胞 衰老基因表达谱的变化,HGEC-40S: 含4096条人类基因,衰老表达差异较大的基因有117种。,24,细胞衰老的基因表达谱研究 衰老细胞与年轻细胞基
14、因(4096条)芯片 杂交信号强度散点图,-2-巨球蛋白,在4096条人类基因的cDNA微阵列表达谱中发现年轻和衰老细胞中表达变化在5倍以上的基因有6种。,其中-2-巨球蛋白基因不仅在衰老的成纤维细胞表达明显增高,在年轻细胞中的表达水平亦较其它5种基因高,易检出,易定量。,青,老,25,衰老过程中基因表达谱的变化 4096种中表达变化幅度2.5倍的基因46种。 下调的基因:参与细胞周期的基因等。 上调的基因:细胞外基质有关基因等。 挑选表达变化大的基因,以RT-PCR技术对其再检测。,26,衰老时表达下降的4种基因,27,衰老时表达增强的5种基因,优选,28,衰老过程中-2-巨球蛋白、 p16
15、Ink 4a和p21Waf1基因表达与代龄关系,-2-巨球蛋白,p16Ink4a,p21Waf1,将-2-巨球蛋白,与众所公认的细胞衰老时表达增强的基因p16Ink4a及p21Waf1相比较,从中选出最适合作为衰老标志物的基因,29,Northern blot 检测2BS细胞衰老过程中 -2-巨球蛋白(alpha-2- macroglobulin, 2M)的基因表达情况,GAPDH 2M,代龄 28 42 52 62,细胞衰老标志基因的选定,30,结论: -2-巨球蛋白基因表达,与体外培养倍增次数线性关系良好,易检出,易定量是一项很好的衰老生物学标志,并有望用于检测整体水平或组织细胞的衰老。
16、马 宏等(Ma H , et al)Exp Gerontol 2004,31,衰老细胞核出现“衰老相关异染色质聚集位点”(senescence- associated heterochromatic foci,SAHF) 染色质在核中的分布,呈点状聚集而非均一分布 李 倩 等:SAHF细胞衰老生物学新标志 。 生物化学与生物物理进展 2007,34:1123-1128.,32,1寻找影响细胞衰老的新基因 发现:延缓衰老的CSIG与RDL 证明:导入CSIG或RDL基因可延长细胞寿命。 2研究各种因素(如氧自由基)对衰老进程的影响 3用于研究已知基因对细胞衰老的影响 发现:已知基因TOM1可加速
17、衰老,抑制可延长细胞寿命 证明:基因导入可影响细胞衰老,可加速,也可延缓。 4检验药物抗衰作用,为中药现代化提供技术支撑,细胞衰老指征的应用,33,为验证我室建立的衰老指标评价体系,评估抗衰新药,我们研究了黄芪碱HDTIC的抗衰作用。,检验药物抗衰作用,为中药现代化提供技术支撑,能否确定被试物的 延衰作用? 能否比较被试物延衰作用的细微差别?,34,黄芪碱 同分异构体,以公认有延缓衰老作用的肌肽(carnosine)为阳性对照,以上述生物学指征进行定量比较。,成果应用,结构差异,(黄芪碱1)(黄芪碱2),(A)HDTIC-1, (B)HDTIC-2,35,黄芪碱的抗衰效应强于肌肽(carnos
18、ine),黄芪碱(HDTIC)可 延长细胞寿命20代( CPDs),成果应用,(黄芪碱1) (黄芪碱2),36,黄芪碱可减慢端粒(Kb数)缩短速度,成果应用,37,阳性(绿色)率随代龄的增加而增加,黄芪碱可降低衰老相关半乳糖苷酶活性,( 28代),( 55代),1.0M黄芪碱-2 ( 56代),成果应用,0.1M黄芪碱-1 ( 58代),38,DNA损伤修复能力 随增龄下降,损 伤 修 复,损 伤 修 复,修复良好,修复不良,黄芪碱可提高DNA损伤修复能力,成果应用,衰老细胞,年轻细胞,尾长(m) 面积/总面积(%) 对照 122.426.21 92.123.25 0.1M黄芪碱-1 80.5
19、75.44 70.827.51 1.0M黄芪碱-2 81.839.37 73.146.34,尾越长,%越高, 损伤越重,39,黄芪碱的抗衰效应强于肌肽(carnosine) 黄芪碱1的抗衰效应强于黄芪碱2,黄芪碱(HDTIC)可减少晚期糖基化终末产物( AGEs),(代龄),(黄芪碱1) (黄芪碱2),王培昌等 ( Wang PC , et al)Mech Age Dev 2003 Chin Med J 2008 DNA Cell Biol 2010,成果应用,40,人类细胞衰老相关基因的研究,41,细胞衰老基因通路,Rb p21Cip1 p27Kip1,p16INK4a p53 PTEN,细
20、 胞 衰 老,42,人类细胞衰老相关基因研究,p16Ink4a,43,Kiyone 等(1998)认为: p16活性与端粒长度是决定人类细胞复制性衰老的关键。 p16为何能影响细胞衰老? 我研究室工作: p16是如何影响端粒长度与衰老进程的? 是否影响了端粒酶的活性?,抑制p16表达,可使 细胞寿命 (60余代 80余代) 端粒缩短减慢 结论: 基因干预可影响细胞衰老进程,44,端粒平均长度 (kb),年轻 8.34,抑制 8.18,增强 7.12,衰老 6.78,抑制 p16,端粒缩短减慢,增强 p16,端粒缩短加快,是否影响了端粒酶的活性?,45,抑制 p16,并未活化端粒酶,46,抑制
21、p16 ,DNA修复能力增强,抑制 p16 , DNA修复能力增强,47,抑制p16,延缓细胞衰老的可能机制 p16减少 细胞周期 蛋白激酶(CDK4)活性高 Rb被磷酸化,失去活性 转录因子E2F活性高多种生命必需基因能表达 维持细胞增殖速度,维持DNA损伤修复能力 端粒缩短较慢,延缓细胞衰老,(需证明Rb是否磷酸化!),48,段建明等( Duan JM, et al.) , J. Biol. Chem. 2001,Western blot,抑制 p16 年轻 对照 中年 衰老,49,p16 影响细胞衰老机制 抑制p16表达 CDK4活性 Rb蛋白(磷酸化 )活性 E2F活性保持多种生命必需
22、基因表达 DNA修复能力维持端粒缩短较慢(与端粒酶活性无关) 延缓衰老,细胞寿命 增强p16基因表达 Rb 保持活力,DNA修复能力 端粒缩短加快,衰老 ,细胞寿命,50,结论: p16基因是细胞衰老遗传控制程序中的主要环节, 可影响DNA损伤修复能力与端粒长度 。它调节Rb蛋白的活性而起作用。 (-2-巨球蛋白基因无此作用),51,衰老相关基因p21可通过转录因子Sp1促进p16INK4a的表达,薛丽香等 ( Xue LX, et al.) FEBS Lett 2004, 564 :199-204,衰老相关基因 p21,p16高表达 (细胞衰老),转录因子Sp1,衰老相关基因存在着相互影响,
23、细胞衰老相关基因p21,52,入选“2002年中国十大科技进展”,53,Cawthon R.M等(2003)端粒长短与人的寿命有关,发现血细胞端粒短的人寿命短。心脏病病死率是端粒长的人3.18倍,传染病病死率是端粒长的人8.54倍。 Nakashima H等(2004)发现:人血白细胞端粒长度与心血管内皮损伤,动脉粥样硬化的关系密切。 Demerath EW等(2004)报道:端粒短与老年糖尿病,创伤愈合慢,免疫功能下降,易生肿瘤有关。,端粒长度与老年病易感性有关?,细胞衰老不能替代整体衰老,但与整体衰老有关,与老年常见多发病有关。,细胞衰老与整体衰老有关,54,老年人群的p16基因多态性与体
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