[农学]微生物发酵培养基概述.doc
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1、微生物发酵培养基概述一培养基的分类:1. 按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分,可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。2. 按照培养基的物理状态分 培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。3. 按照微生物的种类分 培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。4. 按照培养基用途分 培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚,组成成分精确,重复性强,但价格较贵,而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培
2、养基、察氏(Czapek)培养基等。 (2)天然培养基。由天然物质制成,如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤,前者用于培养霉菌,后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定,也难以确定,但配制方便,营养丰富,所以常被采用。 (3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类,或在合成培养基的基础上添加某些天然成分,如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 2.按照培养基的物理状态培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。 (1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂,有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定
3、、计数和菌种保存等方面。 (2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀,微生物能充分接触和利用培养基中的养料,适于作生理等研究,由于发酵率高,操作方便,也常用于发酵工业。 (3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。3.按照微生物的种类培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。 常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基;常用的放线菌培养基为高氏1号培养基;常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基;常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄
4、糖(或蔗糖)琼脂培养基和察氏培养基等。4.按照培养基的用途分培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。 (1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液,用以培养要求比较苛刻的某些微生物。 (2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 (3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品,使培养后会发生某种变化,从而区别不同类型的微生物。二培养基配置的基本过程1.配制溶液 向容器内加入所需水量的一部分,按照培养基的配方,称取各种原料,依次加入使其溶解
5、,最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质,需加热溶解,加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后加水补足。 配制固体培养基时,先将上述已配好的液体培养基煮沸,再将称好的琼脂加入,继续加热至完全融化。并不断搅拌,以免琼脂糊底烧焦。 2.调节pH值 用pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH进行调节,直到调节到配方要求的pH值为止。 3.过滤 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤。 4.分装 已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基,须将培
6、养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基,则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时,一手捏松弹簧夹,使培养基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培养基。分装时,注意不要使培养基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染。 装入试管的培养基量,视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时,每只15150毫米的试管,约装34毫升(1/41/3试管高度),如制作深层培养基,每只20220毫米的试管约装1215毫升。每只锥形瓶装入的培养基,一般以其容积的一半为宜。 5.加棉塞 分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气,避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干
7、燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时,要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与姆指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后,应迅速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札,准备灭菌。 6.制作斜面培养基和平板培养基 培养基灭菌后,如制作斜面培养基和平板培养基,须趁培养基未凝固时进行。 (1)
8、制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.51米左右的木条,厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上,使管内培养基自然倾斜,凝固后即成斜面培养基。 (2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,每皿约倒入10毫升,以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右,待培养基凝固后,再5个培养皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24小时后检查,如培养基末长杂菌,即可用来培养微生物。一、平板划线分离法 由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划
9、线、扇形划线或其他形式的连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。 二、稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如 1 10 、 1 100 、 1 1000 、 1 10000 ),然后分别取不同稀释液少许,与已溶化并冷却至 45 左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操
10、作数次,便可得到纯培养。 三、单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养,称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞他离法的难度与细胞或个体的大小成反比,较大的微生物如藻类、原生动物较容易,个体较小的细菌则较难。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作,挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来,然后移到合适的培养基进行培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求,多限于高度专业化的科学研究中采用。 四、利用选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力,利用这些特性可配制
11、合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基,用它来培养微生物以获得纯培养。 另外,还可以将样品预处理,消除不希望分离到的微生物。如加温杀死营养菌体而保留芽孢,过滤去除丝状菌体而保留单孢子。三工业微生物的筛选菌株分离(separation)就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开,并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选,进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选(screening)虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分:一是从自然界分离所需要的菌株,二是把分离到的野生型菌株进一
12、步纯化并进行代谢产物鉴别。在实验工作中,为使筛选达到事半功倍的效果,总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选:(1)向菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需菌株。(2)由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选。(3)从一些发酵制品中分离目的菌株,如从酱油中分离蛋白酶产生菌,从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择,具有悠久的历史,从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。自然界含菌样品极其丰富,土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物,种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品
13、的含菌量最多。一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分,是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株,空气、水中的微生物也都来源于土壤,所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下,土壤中含细菌数量最多,且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律:细菌(108)放线菌(107)霉菌(106)酵母菌(105)藻类(104)原生动物(103),其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同,在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此,在分离菌株前要根据分离筛选的目的,到相应的环境和地区去采集样品。(一)根据土壤特点1. 土壤有机质
14、含量和通气状况一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富,营养充足,且土壤成团粒结构,通气饱水性能好,因而,微生物生长旺盛,数量多,尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土,植被厚,枯枝落叶多,有机质丰富,且阴暗潮湿,适合霉菌、酵母菌生长繁殖,微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看,15cm的表层土由于阳光照射,蒸发量大,水分少,且有紫外线的杀菌作用,因而微生物数量比525cm土层少;25cm以下土层则因土质紧密,空气量不足,养分与水分缺乏,含菌量也逐步减少。因此,采土样最好的土层是525cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个,并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌
15、、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅,约510cm,霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。2. 土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤(pH7.07.5)环境,适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)环境下,霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同,因此,植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时,其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下,根瘤菌数量比其他植被下占优势。3. 地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多,特别是热带和
16、亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种,如抗生素产生菌,尤其是霉菌、酵母菌,大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高,温暖季节长,雨水多,相对湿度高,植物种类多,植被覆盖面大,土壤有机质丰富,造成得天独厚的微生物生长环境。4. 季节条件不同季节微生物数量有明显的变化,冬季温度低,气候干燥,微生物生长缓慢,数量最少。到了春天随着气温的升高,微生物生长旺盛,数量逐渐增加。但就南方来说,春季往往雨水多,土壤含水量高,通气不良,即使有微生物所需的温度、湿度,也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季,约有710个月处在较高的温度和丰富的植被下,土壤中微生物数量比任何时候都多,因此,秋季采土样最为理想。(二
17、)采样方法用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取525处的土样1025,装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥,可在1030处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离,以免微生物死亡。但有时样品较多,或到外地取样,路途遥远,难以做到及时分离,则可事先用选择性培养基做好试管斜面,随身带走。到一处将取好的土样混匀,取34撒到试管斜面上,这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。二、根据微生物生理特点采样1. 根据微生物营养类型每种微生物对碳氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明,微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土
18、有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等,富含纤维素,适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长;在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中,由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在,因而,在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌;在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所,容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌,通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时,由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶,因此,从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物,从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品,容易得到满意的结果。在
19、油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的株石油降解菌菌株,分别为动胶菌属(Zoogloea sp.)、氮单胞菌属(Azomonas sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。当然,也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集,然后分离筛选。此外,不少微生物对碳源的利用是不完全专一的,如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得
20、能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物,也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。2. 根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时,需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时,通常到温度较高的南方,或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品;分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方,如南北极地区、冰窖、深海中采样;分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压,如从海中筛到一株水活微球菌(Micrococcus aquivivus),它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌
21、时,由于其偏爱糖分高、酸性的环境,一般在土壤中分布很少,因此,通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。三、特殊环境下采样1. 局部环境条件的影响值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外,还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷,年平均温度低,高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中,却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长,实际上也有一些嫌气菌生活,原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气,为嫌气菌创造了局部生长的有利环境,故一般土壤中也能分离到嫌气菌。海洋对于微生物来说是一
22、个特殊的局部环境,尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来,但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件,使海洋微生物具备特殊的生理活性,相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现,20%50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外,美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌,80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA,最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌,产EPA14.78mg/L,在15培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋T
23、hraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时,可参考其中不同种类微生物的分布规律:表层多为好气异养菌,底层由于有机质丰富,硫化氢含量高,厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多,两层中则多为紫硫菌。具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的,能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物,其原因是这里生活这2000万只蝙蝠,它们每晚吃钓5万lb(磅)昆虫,其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层,这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物
24、。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌,这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物,给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌,该菌以木质素为唯一碳源,它对处理过的花生壳的消化率可达到63%,再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%,可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。2. 极端环境条件的影响微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下,也有少数微生物存在,这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境,导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能,因而在冶
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