[临床医学]地塞米松和维甲酸缓释系统预防增生性玻璃体视网膜病变的实验研究.doc
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1、2003届硕士研究生毕业论文:地塞米松和维甲酸缓释系统预防增生性玻璃体视网膜病变的实验研究地塞米松和维甲酸缓释系统预防增生性玻璃体视网膜病变的实验研究山东省眼科研究所研究生 原公强导 师 董晓光教授【摘要】 目的 研究地塞米松和维甲酸缓释系统预防增生性玻璃体视网膜病变的有效性、安全性和玻璃体腔内的药物浓度变化。 方法 1. 取新西兰白兔皮肤瘢痕组织进行成纤维细胞原代及传代培养,采用中轴区玻璃体切除联合成纤维细胞玻璃体腔内注射构建兔眼PVR的动物模型,随机分为5组:A组为空白对照组,B组为空白DDS植入组,C组为DexDDS植入组,D组为RADDS植入组,E组为DexDDS和RADDS联合植入组
2、。术后1、2、3、5天及1、2、4、6、8周,观察术眼前节炎症反应、后节反应及眼压变化。 2. 实验兔眼中轴区玻璃体切除,随机分为2组:F组为DexDDS 本课题受青岛市科技局资助,资助号:2001KNSE2植入组,G组为RADDS植入组,术后1、2、3、5天及1、2、4、6、8周,观察术眼前、后节炎症反应及眼压变化;术后4周和8周各随机选取6只,进行双眼暗适应ERG检查,与术前比较,观察视网膜功能变化;术后8周行视网膜及肝脏、肾脏的组织病理学检查。 3. C、D、E组动物术后1周和8周,以及F、G组动物术后1、2、4、6、8周各随机选取4只,抽取玻璃体腔液,高效液相色谱分析法检测Dex和RA
3、的药物浓度。 结果 1. 术后AE组术眼前节炎症反应分级:A、B组相近,等级最高,D、C、E组依次降低,E组与前4组之间在各个观察点比较差异皆有显著性意义;术后AE组术眼后节反应分级:A、B组相近,等级最高,C、D、E组依次降低,术后发生II级后节反应天数的中位数分别为3d、3d、3d、7d、56d,A、B、C三组之间比较差异无显著性意义,其余各组之间比较差异皆有显著性意义。2. F、G组术后前、后节炎症反应轻微,眼压无明显改变;术前及术后各个观察点双眼暗适应ERG b波波幅比值差异无显著性意义;术后8周视网膜及肝脏、肾脏的组织病理学检查未见毒性反应。 3. DexDDS在植入后1周即达到较高
4、的玻璃体腔药物浓度,持续至6周,其后降低;RADDS在植入后2周内玻璃体腔药物浓度浓度较低,其后明显升高,于6周达到高峰,持续到8周以上。 结论 地塞米松和维甲酸缓释系统玻璃体腔内植入安全,药物浓度适宜。地塞米松缓释系统可以明显的抑制眼内的炎症反应,但并不能有效抑制PVR;维甲酸缓释系统可以明显的延缓PVR;地塞米松和维甲酸缓释系统联合应用,可以有效的抑制PVR。【关键词】 地塞米松;维甲酸;药物缓释系统;增生性玻璃体视网膜病变Antiproliferative Effect of Sustained Drug Delivery System of Dexamethasone and Reti
5、noic Acid in an Animal Model of Proliferative Vitreoretinopathy Shandong Eye Institute & HospitalPostgraduate: Yuan Gongqiang Tutor: Professor Dong Xiaoguang【Abstract】 Objective To investigate the antiproliferative effect,safety and drug concentration of the Dexamethasone Drug Deliverary System (Dex
6、DDS) and Retinoic Acid Drug Delivery System (RADDS) in an experimental animal model. Methods 1. The PVR animal models were made by central vitrectomy with homologous fibroblasts injected in New Zealand albino rabbits, which were divided into 5 groups at random: Group A is the control group; In group
7、 B, C, D and E, blank DDS, DexDDS, RADDS and both DexDDS and RADDS were implanted into the vitreous cavities respectively after vitrectomy. Each group was observed 8 weeks postoperatively, registering the anterior chamber flare and the development of the proliferative vitreoretinopathy (PVR). 2. The
8、 animal models were divided into 2 groups at random, which were undergone central vitrectomy and DexDDS and RADDS were implanted into vitreous cavities in group F and G respectively. Each group was observed 8 weeks postoperatively, registering the inflammation of anterior and posterior segments and
9、IOP; 6 rabbits from each group were undergone scotopic ERG at 4 and 8 weeks postoperatively; the retina, liver and kidney toxicity was evaluated by histopathological examinstion. 3. 4 rabbits from group C, D, E at 1 and 8 weeks postoperatively, and 4 rabbits from group F and G at 1, 2, 4, 6 and 8 we
10、eks postoperatively were undergone inspiration of 0.3ml vitreous cavity fluid, to measure the concentration of the dexamethasone and retinoic acid by HPLC. Results 1. The degree of anterior chamber inflammation: group A, Bgroup DgroupCgroup E; the development of PVR: group A, Bgroup Dgroup Cgroup E.
11、 2. The inflammation of anterior and posterior segments in group F and G were mild, and the IOP were stable; the differences of the ratio of the ERG b wave amplitude between bilateral eyes preoperatively, 4 and 8 weeks postoperatively were not significant statistically; No retina, liver and kidney t
12、oxicity was found in the histopathyology examination. 3. The concentration of dexamethasone in vitreous cavities elevated rapidly in the first week and lasted to 6 weeks postoperatively; the concentration of retinoic acid in vitreous cavities were lower before 2 weeks, and elevated to the peak conce
13、ntration at 6 weeks and at least lasted to 8 weeks postoperatively. Conclusions DexDDS and RADDS were safety in vitreous cavity and the drug concentration in vitreous cavities was suitable and stable. DexDDS could inhibit the inflammation postoperatively; RADDS could postpone the development of PVR;
14、 both DexDDS and RADDS implanted in association could inhibit PVR effectively. 【Key words】 Dexamethasone;Retinoic Acid;Drug Delivery System;Proliferative Vitreoretinopathy前 言增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative Vitreoretino- pathy, PVR)是指由孔源性视网膜脱离及穿通性眼外伤所引起的增生性病变,其实质是眼组织对于创伤产生的超强的修复作用。目前公认增生性玻璃体视网膜病变是一个细胞介导的病理
15、过程,视网膜色素上皮细胞和胶质细胞离开了原来的正常位置,在多种细胞因子的共同作用下,迁移到玻璃体腔及视网膜的前、后表面,形成具有收缩力的细胞性膜,膜的收缩使得其所附着的组织扭曲变形,发生在临床上可见的视网膜血管扭曲、视网膜表面膜形成、视网膜下条索,进而形成视网膜全层固定皱褶,严重时形成漏斗状视网膜脱离。增生性玻璃体视网膜病变中增生膜的主要细胞成分是视网膜色素上皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞,其中以视网膜色素上皮细胞的作用最为重要,视网膜色素上皮细胞广泛参与PVR形成与发展的整个过程。PVR的治疗主要有手术和药物两种手段。目前PVR的治疗方法主要以玻璃体手术为主,手术中通过剥除增生膜,松解牵拉紧张的
16、视网膜,使之复位,然后在眼内填充长效气体或硅油。手术的成功率在4580左右1。玻璃体手术并不能防止增生性病变的进一步发展,而且手术刺激会促进PVR的进一步发展2,只有合理的应用抗增生药物,才能真正防止PVR 的发生发展。近年来许多学者致力于此类药物的研究,如糖皮质激素3、氟尿嘧啶4、柔红霉素5等,取得了一些成果。但是这类药物全身应用副作用大,费用高,而且由于血眼屏障的存在,难以达到有效的眼内药物浓度;尤其对于眼后节疾病,点眼等常见的局部用药方法亦难以达到玻璃体视网膜局部有效的药物浓度。因此,改变药物的给药途径和剂型,以达到并在治疗期间维持眼内有效的药物浓度是近年来眼科学者研究的热点。眼内缓释药
17、物的研制和发展,为PVR等难治性玻璃体视网膜疾病的治疗开辟了一条崭新的途径。本研究采用乳酸与羟基乙酸的共聚物聚乳糖酸(polylactioglycolic acid, PLGA)作为药物载体,观察地塞米松药物缓释系统、维甲酸药物缓释系统及两者联合应用对兔眼实验性PVR的预防作用,观察这两种药物缓释系统玻璃体腔植入的安全性和玻璃体腔内的药物浓度变化。材料与方法一、实验材料1.实验动物健康成年新西兰白兔61只(购自山东鲁抗医药集团有限公司),体重22.5kg,雌雄不限,山东省眼科研究所动物实验室饲养。实验动物符合ARVO有关用于研究目的动物的相关规定。2.药物缓释系统(见图1)(1)地塞米松(天津
18、药业有限公司),纯度99.9;(2)全反式维甲酸(上海第六制药厂),纯度99.81%;(3)缓释系统:载体材料为聚乳糖酸(PLGA)。每粒地塞米松缓释系统(Dexamethasone Drug Deliverary System, DexDDS)含地塞米松药量分别为3mg、1mg,药物与载体的重量比为W/W=2/3,缓释系统分别重7.5mg、2.5mg,直径1.5mm,预期释药时间8周。每粒维甲酸缓释系统(Retinoic Acid Drug Deliverary System, RADDS)含全反式维甲酸药量为1mg,药物与载体的重量比为W/W=1/3,缓释系统重4mg,直径1mm,预期释药
19、时间8周。本药物缓释系统由山东省眼科研究所与中国科学院化学研究所共同研制,由中国科学院化学研究所制作提供,维甲酸缓释系统专利号02102477.4。缓释系统单粒分装入0.5ml有色EP管中,置于暗盒,环氧乙烷熏蒸24小时灭菌(青岛市市立医院制剂室),放置1周后备用,避光保存。3. 实验用主要仪器和耗材:CO2细胞培养箱:Heraeus, BB5060型, 德国;6孔培养板、250ml培养瓶、15ml离心管等细胞培养耗品由美国Costar公司购买;玻璃体切割仪:Stoze, Premiere型,美国;裂隙灯显微镜:Topcon,SL-7F型,日本;双目间接检眼镜:Keeler,Vantage型,
20、英国;眼底照相机:Canon,CF-60UD型,日本;接触式眼压计:Mentor,Tono-Pen XL型,美国;高效液相色谱分析仪:Agilent,1100型,美国;眼电生理仪:Nwuropack ,MEB-5504K型,日本。4. 实验试剂:(1)RPMI-1640干粉培养基由美国Gibco公司购买。(2)新生牛血清由杭州江滨生物技术有限公司购买。5. 细胞培养液及试剂的配制(1)RPMI-1640培养液的制备:RPMI-1640干粉培养基10.4g加入900ml双蒸水中,再加入2.0g NaHCO3,搅拌使其充分溶解,补充双蒸水至1000ml,调整PH值至7.3,N2正压抽滤灭菌,4C冰
21、箱保存备用。(2)细胞培养液:每100ml细胞培养液中含RPMI-1640 培养液90ml、新生牛血清10ml,同时加入青霉素和链霉素,使二者的浓度达到100IU/ml,4C冰箱保存备用。(3)Hanks液:用3.5%NaHCO3 4滴滴在0.02g酚红上,使其充分溶解,然后加入NaCl 8.0g、Na2HPO412H2O 0.06g、KCl 0.4g、KH2PO40.047g,加双蒸水至1000ml,调整PH值至7.3,过滤分装于250ml瓶内,封盖,10磅气压10分钟灭菌,4C冰箱保存备用。(4)细胞传代用消化液:0.25%胰蛋白酶溶液和0.02 %乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液的混合消
22、化液。二、实验方法(一)成纤维细胞培养1.兔皮肤瘢痕动物模型构建取成年健康新西兰白兔1只,盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)50mg/kg、盐酸氯丙嗪注射液(上海禾丰制药有限公司)25mg/kg、硫酸阿托品注射液(徐州莱恩药业有限公司)0.015mg/kg联合肌肉注射麻醉。麻醉成功后,剪除背部5cm5cm 范围的兔毛,0.2% I型安尔碘(上海利康消毒高科技有限公司)消毒手术区,铺无菌手术巾,无菌眼科弯剪剪除其中央大约3cm3cm范围的皮肤,保留皮下组织,创面涂0.5%红霉素眼膏(山东鲁抗辰欣药业有限公司)。术后每日早晚两次以0.2% I型安尔碘消毒手术区周围皮肤,创面涂0.5%红霉
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