[生物学]抑制性削减杂交PCR1.doc
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1、抑制性削减杂交PCR一 产品简介削减杂交是一套使研究人员能够比较两种mRNA群和获得仅在一种mRNA群表达而在另一种mRNA群没有表达的克隆子的强有力的技术。虽然分析差异表达有几种不同的方法,但削减杂交背后的基本理论却非常简单。首先,两组mRNA均转化为cDNA:我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”,对照cDNA称为“driver”。Tester和Driver cDNA进行杂交,接着去除杂交序列。结果,保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达,而在driver组不表达的mRNA。Molecular basis of PCR-Select cDNA subtra
2、ction虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用,但要求好几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。CLONTECH PCR-Select cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示PCR-Select过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5-2mg polyA+ RNA,花34天时间,也不用分离ss和ds分子。而且,抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA过程中消减杂交分子事件。首先,cDNA从0.5-2mg的两种比较组织材料polyA+ RNA合成。Tester和drive
3、r cDNA以Rsa酶切,该酶为一四碱基限制性内切酶,能产生平末端。Tester cDNA接着分成两部分,每一部分连接上一个不同的cDNA adaptor。 Adaptor的末端无磷酸基团,因此仅有adaptor的一链与cDNA 5末端相连(防止adaptor自连)。两adaptor具有不同的序列,这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。接着进行两轮杂交。在第一轮杂交中,将过量的driver cDNA 加入到两份tester样品中,然后热变性和退火,在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。由于杂交二级动力学的原因,高丰度分子退火快,因此高和低丰度序列在
4、a型分子中的浓度趋于均衡。同时,a型的双链分子明显地富集差异片段,就如与driver杂交中没有差异表达的c型ss分子明显富集。在第二次杂交期间,两份第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在,仅有保持平衡的和消减的ss tester cDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同接头的ds DNA分子,分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(与adaptor2相连)。将新变性的driver cDNA加入无需再次变性的已经第一次杂交反应的两混合物,进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后,e型分子差异表达的tester序列在5和3端具有与巢式
5、引物配对的不同的退火位点。 接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在PCR中,a和d分子无引物退火位点,因而不能被扩增。由于抑制性PCR效应,绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增(Appendix A)。c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有e型分子,有两个不同adaptor,能被指数扩增,产生均衡的差异表达序列。 进而,用巢式引物进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时,差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体。可以选择使用接头1的Not I (Sma I, Xma I)位点和接头2R的Eag I (例,使用CLONTECHs Adva
6、ntage PCR Cloning Kit, #k1901-1)或任何使用Rsa位点作为adaptor/cDNA 连接的载体。然后,差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。 PCR-Select differential screening获得消减cDNA文库后,重要的是确认代表差异表达基因的的单个克隆,This is typically accomplished by probing Northern blots with randomly selected, subtracted clones。然而这既耗时又低效,尤其是关系很近的RNA po
7、pulations相互比较消减文库中可能包含相当数量的假阳性。在Northern杂交分析前利用消减文库的差异筛选有助于减少假阳性,节省时间和精力。在差异显示中,来自于杂交文库的克隆子与来自于检测子或者驱动子的标记探针进行点杂交。那些能被检测子探针识别而不能被驱动子探针识别的克隆子就能确认是差异表达的片段。PCR-Select differential screening试剂盒中包含所有差显文库检测的必要试剂,包括对照和使用说明。为了提高PCR-Select differential screening试剂盒的灵敏度,应该进行两次杂交:原始预设杂交(正向杂交),另外就是检测子与驱动子互换的反向杂
8、交。关于更多差异显示的信息,见Section VI。使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit如果你的起始材料有限,你可以用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit (#k1054-1)预先扩增你的总RNA以用于PCR-Select Kit。当总RNA 用常规方法合成cDNA时,即便是使用Oligo(dT)引物,核糖体RNA也会同polyA+ RNA一起被反转录。如果这种cDNA用于PCR-Select Kit,过量的核糖体RNA和低浓度的与PolyA+ RNA相对应的cDNA浓度将导致无效减法杂交。使用Super SMARTT
9、M PCR cDNA Synthesis Kit合成的cDNA可直接用于PCR-Select杂交,甚至于使用总RNA作起始模板。由Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit合成的cDNA,直接进入接头连接部分(Section IV.F)。但是,也必须用PCR-select进行对照cDNA的合成与杂交(Section IV.C.)。 (注意:由Super SMARTTM PCR cDNA Library Construction Kit #K1051-1合成的cDNA不能用于PCR-Select Kit。)一旦差显片段确定,SMARTTM RACE cDNA Amp
10、lification Kit (#K1811-1) and Marathon-ReadyTM cDNAs (many)能够快速克隆相应的全长cDNA。更多的信息见相关产品部分(Section VIII)。cDNA合成 以待比较的两组mRNA合成tester和driver ds cDNA Sections IV.C & IV.D Rsa消化Tester和driver cDNA分别消化以获得短的平末端分子 Section IV.E Adaptor连接试验组平分成两份,分别连上不同的adaptor, 但driver cDNA无adaptor Section IV.F 第一次杂交 杂交动力学导致均衡和
11、富集差异表达序列 Section IV.G 第二次杂交 以产生用于PCR扩增模板的差异表达序列 Section IV.H 第一次PCR扩增 使用抑制性PCR,仅差异表达的序列呈指数级扩增 Section IV.I 第二次PCR扩增 背景减少,不同表达的序列进一步富集 Section IV.I图1. CLONTECH PCR-Select过程的概况。含特异转录物cDNA称为tester,对照cDNA称为driver。 如果使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit合成的cDNA,直接进入接头连接部分(Section IV.F)。 图2 PCR-Select cD
12、NA subtraction示意图。在检测子cDNA文库仅有上调序列形成e型分子。实心线代表由Rsa酶切消化的检测子和驱动子cDNA。实心盒代表接头1和2R长链的外端部分与PCR引物1序列互补。空心盒代表接头1的向内部分与巢式PCR引物1序列互补。阴影盒代表接头2R的向内部分并与巢式PCR引物2R序列互补。二、试剂成分表 RNA存于-70,储存4杂交液于室温。其它储存于-20。本试剂盒提供的足够7次cDNA合成的试剂。每次反应最好使用2mg polyA RNA,但也可少至0.5mg。但是,如果使用低于2mg的polyA RNA,在消减过程中,低丰度的差异cDNA可能丢失。7次cDNA合成相当于
13、6次完全的消减实验和1次对照。如果每次合成用于不同实验的tester和driver(在特殊系统鉴定上调或下调cDNA),PCR试剂足够50次初级和100次次级PCR反应。参阅附录B的primer和adaptor序列。 第一链的合成 7ml AMV反转录酶(20u/ml)10ml cDNA合成引物 (10mM)200ml 5第一链缓冲液250mM Tris-HCl (pH8.3)40mM MgCl2150mM KCl 5mM Dithiothreitol(DTT二硫苏糖醇)第二链合成 *28ml 20第二链酶混合物 (DNA多聚酶1,6u/ul,RNase H, 0.25u/ml, E.coli
14、 DNA连接酶,1.2u/ml) *200ml 5第二链缓冲液 500mM KCl 50mM Ammonium Sulfate (硫酸氨) 25mM MgCl2 0.75mM b-NAD 100mM Tris-HCl (pH7.5) 0.25mg/ml BSA牛血清白蛋白 *14ml T4 DNA多聚酶(3u/ml) 内切酶消化 *300ml 10Rsa1 限制缓冲液 100mM Bis Tris Propane-HCl (pH7.0) 100mM MgCl2 1mM DTT *12ml Rsa (10u/ml) Adaptor 连接 *21ml T4DNA 连接酶 (400u/ml; 含3m
15、M ATP) * 30ml Adaptor1 (10mM) * 30ml Adaptor2R (10mM) *200ml 5DNA连接缓冲液 250mM Tris-HCl (pH7.8) 50mM MgCl2 10mM DTT 0.25mg/ml BSA Adaptor 2R是在1996年12月时重新设计,在重新设计之前这个接头被命名为Adaptor 2,与现在这个接头序列不同;但是,注意在一些PCR-Select Kit产品中,重新设计的Adaptor 2R仍然被命名为Adaptor 2。如果你使用的试剂盒中为#PR6Y996版本的使用说明,Adaptor 2与Adaptor 2R序列是相同
16、的。杂交 *200ml 4杂交缓冲液 *1.4ml 稀释缓冲液(pH8.3) 20mM HEPES (pH6.6) 20mM NaCl 0.2nM EDTA (pH8.0) PCR扩增 *50ml PCR引物1 (10mM) *100ml 巢氏PCR引物1 (10mlM) *100ml 巢氏PCR引物2R(10mM) *10ml PCR质控消减cDNA 对照试剂 *5ml 对照polyA RNA (1mlg/ml;来源于人骨骼肌) *10ml 对照DNA (3ng/ml ) (Hae -消化的细菌噬菌体fx174 DNA) *50ml G3PDH 5 引物(10mM) *50ml G3PDH
17、3 引物 (10mM) 这些引物可以扩增人、大鼠、小鼠G3PDH基因 一般试剂 *20ml dNTP*混合物 (10mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP ) *100ml 20EDTA/glycogen mix (0.2M EDTA; 1mg/ml glycogen) *400ml NH4OAc (4M) *1ml 灭菌水 三、另外所需试剂 下面的试剂是需要的,但本试剂盒未提供。*Hae 消化的噬菌体fX174(#6310-1,-2):凝胶上DNA Marker用。 *0.5mlPCR反应管 推荐Perkin-Elmer GeneAmp 0.5-ml reaction
18、tubes (#N801-0737 or N801-0180).*80%和96%乙醇 *酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)按下配制: 1、 重蒸酚 2、 等体积灭菌TNE缓冲液平衡(50mM Tris,Ph7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA) 3、 室温下2-3小时 4、 去除上层水相 5、 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),完全混合,去除上层相 6、 储存下层酚:氯仿:异戊醇于4,最多2周 *氯仿:异戊醇(24:1) *50PCR酶混合物 推荐Advantage cDNA Polymerase Mix (#8417-1; alsoprovided in the Advant
19、age cDNA PCR Kit #K1905-1,-y)。本手册的方案就是根据此酶进行的优化。这种50 X混合物含有KlenTaq-1 DNA Polymerase (anexo-minus, N-terminal deletion of Taq DNA polymerase),一个校正酶,含有TaqStartTM抗体能自动进行热启动。另外,如果单独使用Taq DNA polymerase,需要在初级和次级PCR反应中进行3-5次额外的热循环。但额外的循环会产生高背景并导致杂交文库中低百分比的差异表达克隆子。注意:如果你没有选择使用Advantage cDNA Polymerase Mix,
20、请使用TaqStart Antibody(#5400-1, -2)手册进行热启动,或者与蜡球wax beads混合进行热启动以减少非特异性DNA合成。*10PCR缓冲液 使用与DNA酶成套的10PCR缓冲液*PCR中使用的dNTP混合物(10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) *50TAE 电泳缓冲液 242g Tris碱 57.1ml 冰醋酸 37.2g Na2EDTA.2H2O 加水至1升。将50倍贮液与水按1:49稀释得1X TAE电泳缓冲液。四、Clontech PCR-Select cDNA消减步骤 使用前请阅读完整个实验方案。A、一般事项 *戴手套以防RNA和cD
21、NA样品被核酸酶降解。 *本手册的循环参数已使用Perkin-Elmer DNA Thermal Cycle 480和 Perkin-Elmer GeneAmp Systems 2400/9600优化。不同的循环仪可能需要不同的循环次数、50polymerase 混合物和模板。*如果你准备使用本试剂盒,需要进行两次杂交:原始预设杂交(正向杂交),另外就是检测子与驱动子互换的反向杂交。关于更多差异显示的信息,见Section VI。*必须使用热启动以减少非特异DNA合成。我们推荐TaqStart Antibody或人工热启动。本方案已用TaqStart抗体优化好(包含在Clontechs Adv
22、antage cDNA Polymerase Mix中) *悬浮沉淀和混合反应时,轻轻上下吹打,短暂离心以将成分沉于管底。 *用旋涡振荡酚:氯仿抽提混合物 *向混合物中最后加酶,轻轻上下吹打以将酶和混合物混匀 *不要增加酶量和反应的DNA浓度。量和浓度已优化好了。 *虽然不是要求的,推荐使用a-32PdCTP进行第一链合成以定量产生的cDNA,确定DNA沉淀的效率,以利解决某些时候合成cDNA的困难。 B、RNA的准备和处理 1、一般注意事项 完整的、纯的polyA RNA是合成高质量cDNA所必须的。为了避免RNA污染和降解,将RNase减少到最低程度,使用下面注意事项: 戴手套以避免手上的
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