[药学]药理学实验详解.doc
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1、药理学实验详悉一、动物实验动物实验是根据研究目的,恰当地选用标准的符合实验要求的实验动物,在设计的条件下,进行各种科学实验、观察、记录动物的反应过程或反应结果,以探讨或检验生命科学中未知因素的专门活动。动物实验是人类生存和发展的必要手段。动物实验方法是进行动物实验时的各种实验手段、技术、方法和标准化操作程序。也探讨实验动物科学中的减少、替代、优化问题。实验动物的选择:首先应从生物医学研究的目的和实验要求来选择实验动物,进而考虑实验动物是否容易获得、是否经济、是否容易饲养。一切实验动物应具有个体间的均一性,遗传的稳定性和容易获得三个基本要求。标准化原则:根据对实验质量的要求选择标准化的实验动物
2、。动物实验中选择和使用与研究内容相匹配的标准化的实验动物标准化动物:是指遗传背景明确或来源清楚的,对其携带的微生物和寄生虫实行控制,模型性状显著且稳定的动物。在精确试验中,鉴于动物体内外的微生物和寄生虫会干扰试验的结果,最好选择无菌动物或悉生动物,至少也应SPF级动物。规格化原则:选择与实验要求一致的动物规格。实验动物年龄与体重一般呈正相关性,可按体重推算年龄。一般来说,实验动物年龄、体重应尽可能一致,相差不得超过10%。不同性别的动物对同一药物的敏感程度是有差异的,如实验无特殊要求应选择雌雄各半做实验,以避免因性别差异所造成的结果误差。 特殊的生理状态下,如发情、妊娠及哺乳期,机体对实验的反
3、应性发生改变。实验动物的选择应用应注意有关国际规范:GLP、SOP、“3R”(Replacement替代 Reduction减少 Refinement优化)(一)实验动物:系指遗传背景明确、来源清楚、对其携带的微生物、寄生虫实行控制,经科学方法人工培育用于科学实验的动物。(二)实验动物的分类方法1、按遗传学控制分类*近交系:杂种动物经过相当于20代全同胞兄弟单纯连续繁殖,各条染色体上的基因趋于纯合,品系内个体差异趋于零。近交动物的特征:a、纯合性和一致性纯合性指的所有动物的基因位点都应是纯合的。一致性指的是任何可遗传的体征都完全一致。例如:血型和组织型,体重、毛色。b、遗传稳定性c、特异性就整
4、个近交系小鼠而言,每个近交系在遗传上都是独特的,几乎每个近交系都建立了各自的遗传概况。d、分布于各地,引一对即可繁殖。e、背景资料和数据较完整。*封闭群:以非近亲配种方式进行繁殖生产的一个种群,在不从外部引入新血缘条件下,至少连续繁殖四代以上。封闭群的特点:a、由于非近交,具有杂合性,从而避免近交衰退的出现。b、由于没有引进新的血缘,种群间遗传特性能保持相对稳定。c、群内个体间,因其具有杂合性,所以个体间的反应性具有差异,重复性和一致性不如近交系。2、按微生物学分类*普通级动物 Conventional(CV)Animal:不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。*清洁动物 Cle
5、an(CL)Animal:除普通级动物应排除的病原体外,不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。饲养在屏障系统中。空气要经过滤净化,饲养室要保持正压,进入室内的切物品要经过消毒灭菌,工作人员进入要洗澡和穿灭菌工作服,动物饮水要经灭菌。*无特定病原体动物 SpecificPathogenfree(SPF)Animal:除清洁动物应排除的病原外,不携带主要潜在感染或条件致病菌和对科研干扰大的病原。饲育在屏障系统中,是通过无菌动物、悉生动物、SPF 动物而获得的。笼具、饲料饮水都要经过特殊处理,并有严格的检疫、消毒、隔离制度。国外所作的科研实验主要使用 SPF 动物。*无菌动物 Germfre
6、e(GF)Animal:无可检出的一切生命体。此种动物自然界中并不存在,它是经人工剖腹产净化培育出来的。在隔离器中剖腹产取出其仔体,用无菌母鼠代乳或人工哺乳。悉生动物(GnorobioticAnimal):动物体内所携带生命体(病毒、细菌、真菌、原虫和寄生虫)是已知的,也叫已知菌动物。 (三)动物实验设施的分类:l、开放环境(Open environment):饲育环境与外界相同,有强力通风设施,饲料、饮水和垫料要求不被污染,应有防鼠,防昆虫措施。2、屏障环境 (Barrier environment)洁净度万级:饲育环境是密闭的。送入的空气需经过滤,洁净度达到万级,饲料、饮水、垫料需灭菌后方
7、可使用,饲养人员进入要经过淋浴,穿无菌工作服,戴口罩、手套。3、隔离环境 (Isolation environment)洁净度百级:是一个隔离器(Isolator)为主体及其它附属装置组成的饲养系统,送入的全新风要经百级以上洁净度过滤,一切物品都要经严格灭菌后经传递仓送入,饲养人员不得入内。(四)P 级实验室:指不同生物安全级别(病原体危险程度的分类)一类(P1 级):在通常条件下;,没有或很少有危险的病原体。实验室的设汁与清洁级实验动物实验室相似,并配备般微生物实验室所需仪器和设备。二类(P2 级):有一般潜在危险性的病原体。用一般实验技术可以预防,而在一些意外情况,如注射器刺伤皮肤,可引起
8、疾病,须配备生物安全框。三类(P3 级):具有特殊危险的病原体,需特许才能引进,包括 23 种病原体。四类(P4 级):对实验人员极端危险或可造成严重流行病而需要严格控制条件的病原体。还包括由国外进口的属于三类的病原体。常用实验动物一、小鼠 Mouse; Mus Musculus 特别适用于需要大量动物的药物筛选、半数致死量测定、药效评价等实验研究。因其繁殖能力强,妊娠期仅为21天,因而也常用于避孕药的研究。由于其器官易发实质性损害,常用于致畸、致癌药及抗癌药的研究。 生物学特性1一般特性 体型小。小鼠体小娇嫩,皮肤无汗腺,对外界环境适应能力差,怕热畏寒,不耐饥饿,对外部刺激敏感,抵抗力弱。代
9、谢率高,平均呼吸次数100+次/分、心率300+次/分。性情温顺,易于实验操作。 喜群居,昼伏夜动。小鼠为群居动物,群养时生长发育较单饲快,另一方面,过分拥挤也会抑制生殖能力。 小鼠性成熟早,非同窝的雄性在一起易互斗并咬伤,表现为群体中处于优势者保留胡须,而处于劣势者则掉毛,胡须被拔光。当群饲时,饲料的消耗量比单个饲养为多、生长发育更快。 小鼠喜居光线暗淡的环境,习惯于昼伏夜动,其进食、交配、分娩多发生在夜间。小鼠活动高峰每天有两次,一次在傍晚后12h,另一次在黎明前。2生理学特性 成年体重:20-40g;18-35g,常用体重18-22g。寿命:1-2年。 生殖生理。属全年、多发情期动物,生
10、长期短、成熟早、繁殖力强,体成熟雄鼠为7080d,雌鼠为65 75d,故小鼠开始繁殖一般是在6590d之间。妊娠期19 21天;哺乳期20 22天;一年6 9胎,每胎产子数为8 15只。小鼠性活动可维持1年左右。 性别鉴别成年动物:雄性有明显的睾丸囊,雌性在生殖突起后可见明显的阴道。幼龄动物:主要观察生殖器与肛门之间的距离,雄性的距离较远,雌性的距离较近。此外,也可辅助观察生殖器与肛门之间的差异,雌性为一无毛小沟,雄性有毛。3. 解剖学特点 乳腺Mammaries 小鼠有5对乳腺: 3对位于胸部; 2对位于腹部; 乳腺组织可延伸到后背和肩部,因此,乳腺肿瘤常常在距离乳头很远的位置发生。 骨骼特
11、征Skeletal Features 小鼠与其它实验动物明显不同的骨骼特征包括:连接胸骨与肋骨之间的软骨通常发生钙化;小鼠长骨骨髓的大部分终生具有造血功能(对于大部分成年哺乳动物,这些骨髓大部分被脂肪代替)。 小鼠消化道及附属器官 小鼠的食管缺乏在其它动物中常见的粘液腺,表面被覆复层鳞状上皮,在胃小弯的中央进入胃中而不是在胃顶端。 小鼠的胃分为有腺部和薄壁的无腺部,无腺部与食管一样被覆复层鳞状上皮。有腺部与其他大多数实验动物类似。 小鼠的胰腺呈小叶状疏松的结构,散在分布于肠系膜中,肉眼不易鉴别。一个胰腺管直接进入十二指肠,另一个进入共同胆道。通常小鼠还有附加的胰腺管道直接通入十二指肠。 结肠没
12、有结肠袋。(在家兔的结肠特别明显) 小鼠的肝脏由4个叶组成,较大的中间叶、右侧叶和左侧叶、以及左尾叶。胆囊或者位于尾叶上或者位于中间叶背侧表面。 脾脏 Spleen 雄性小鼠的脾脏比雌性小鼠大50%,当比较器官重量的研究数据时应引起注意。 胸腺 Thymus 胸腺位于胸腔入口处,由大小不等的两个叶组成,覆盖在主动脉弓表面。成年小鼠的胸腺呈叶片状很薄,而其他成年动物的胸腺相对要厚一些。 泪腺 Lacrimal Glands 小鼠的泪腺有一些特殊结构,例如,Harderian glands,位于眼后方,部分围绕视神经。这些腺体分泌一些油样的物质至瞬膜表面,起到润滑的作用。分泌物中由于包括红色的染料
13、物质-卟啉,因此,在一些非特异性的应激状态下,由于分泌增加,常常造成眼周和鼻子周围的被毛呈红色。 棕色脂肪 Brown Fat 小鼠有较多的棕色脂肪分布于机体各处,例如,肩胛骨之间的颈部区域、肾周围和胸腺周围。 棕色脂肪可能是动物的热能来源,在冬眠的动物中尤其多见,例如仓鼠。常用品种、品系近交系国内培育的近交系 TA1、TA2(津白1号、津白2号):白色。天津医学院分别于1955年和1963年以普通KM(昆明)小鼠近交20代培育而成。TA1肿瘤自发率低,TA2高发乳腺癌。TA2可作为乳腺癌MA737的荷瘤动物。 615小鼠:是一种深褐色的近交系小鼠。为1961年中国医学科学院输血和血液研究所,
14、将普通KM小鼠与C57BL/血研杂交后,经20代以上近交培育而成。该品系对津638白血病病毒敏感,可作为L615白血病的荷瘤动物。肿瘤自发率为10-20%(乳腺癌,肺癌)。 C-1(中国1号):1955年中国医学科学院实验医学研究所,将普通普通KM小鼠近交20代培育而成。该品系繁殖率中等,肿瘤自发率低。 AMMS/1:1974年军事医学科学院实验动物中心,将普通KM小鼠近交20代培育而成。对炭疽弱毒株较敏感。 SMMC/C、SMMC/B:1977年,第二军医大学的胡开元教授将普通KM小鼠近交20代培育而成。对约氏疟原虫敏感。骨髓粒系祖细胞对辐射极敏感,白细胞低,乳腺癌自发率高达80.3%。 L
15、IBP/1,兰州生物制品所1979年育成,对流行性出血热病毒和炭疽杆菌敏感。南京军区总医院动物中心孙敬方培育成NJS,是高血脂的动物模型。解放军81医院薄侃培育成白内障近交系小鼠。 封闭群1、KM(昆明)小鼠 白色封闭群小鼠,为我国分布最广、使用最多的小鼠。KM小鼠的特点是高产,抗病力强,适应性强。常见的自发性肿瘤为乳腺癌,发病率约25%。目前,广泛用于药理、毒理、病毒和细菌学研究,以及药品、生物制品的检定。 2、ICR小鼠 白色封闭群小鼠,国际上应用最广泛的封闭群小鼠之一,又称:Swiss Hanschka,是美国Hauschka (Rosuell Park Memorial Institu
16、te)饲养的Swiss小鼠。以后由美国肿瘤研究协会分送给各个研究所,因此命名为ICR。该品种小鼠生育能力高。我国于1973年从日本国立肿瘤研究所引进。3、NIH小鼠白色封闭群小鼠,由美国NIH动物中心育成,也来源于Swiss小鼠。中国药品生物制品检定所动物中心在早期也有引入。该品种小鼠的特点是繁殖力强,产子成活率高。雄性好斗,容易打伤致残。广泛用于药理、毒理研究以及生物制品的检定等。4、CFW小鼠 白色封闭群小鼠,起源于Webster小鼠,1935年英国Carwarth 从Rockfeller研究所引进,经过20代兄妹交配后,再采用随机交配而育成。我国1973年从日本国立肿瘤研究所引进。5、L
17、ACA小鼠 白色封闭群小鼠。英国实验动物中心引进CFW后,改名为LACA。1973年,我国从英国实验动物中心引入。二、大鼠 Rat, Rattus Norvegicus 常用作亚急性和慢性毒性实验。大鼠的血压反应比家兔好,常用来直接描记血压,进行降压药的研究。它的垂体肾上腺系统功能发达,可作为应激反应和肾上腺、垂体及卵巢等内分泌实验。大鼠无胆囊,因此用其做胆管插管收集胆汁,进行消化药的研究。大鼠的踝关节对炎症反应敏感,也用于治疗关节炎的药物研究。 一般生物学特性1一般特性 昼伏夜行。昼间睡眠,夜间和清晨比较活跃,采食、交配多在此期间发生。 性情较温顺,能耐受孤独。与小鼠一样,皮肤汗腺不发达。仅
18、在爪垫和尾巴上有汗腺。 不能呕吐。对维生素、氨基酸缺乏敏感,可发生典型的缺乏症;有食粪的特性。 大鼠和小鼠的心电图中没有S-T段,甚至有的导联不见T波,但是,心电图的其它成分很稳定,重复性好。 2生理学特性 成年体重:300-400g;250-300g。常用体重:180-220g,寿命:2.5-3年。 全年多发情期动物,繁殖率高。妊娠期21-23天;哺乳期21天;每胎产子数为8-14只。 性别鉴别与小鼠相似。 可通过阴道涂片变化来判断发情周期,有成熟的人工授精技术和同期发情技术。交配后也有阴道拴产生,可作为受孕的标志。3. 解剖特点 大鼠的解剖特点与小鼠十分相似,只有很少的例外。 心脏供血既来
19、自冠状动脉,也来自冠外动脉,后者起源于颈内动脉和锁骨下动脉。 骨骼系统Skeletal System 大鼠结构上终生生长。亦即大鼠的长骨生长中心(骨骺)不发生闭合,终生持续生长。但是与小鼠不同的是,成年大鼠的长骨骨髓大多被脂肪所替代。 消化系统特点Features of the Rat Digestive System l 大鼠的胰腺同小鼠一样散在分布于肠系膜,但是它有许多胰管直接通入十二指肠。l 大鼠的肝脏也分为4个叶,但其排列与小鼠不同。大鼠肝脏的右叶分为前后叶,一个较大的左叶和一个小尾叶。l 大鼠一个重要的解剖特点是无胆囊,这点与马一样,缺乏胆囊的储存胆汁功能,胆汁持续的进入十二指肠。
20、封闭群1、Wistar 大鼠l 白化封闭群饲养大鼠。l 1907年由美国Wistar研究所育成。我国从日本、前苏联引进。是我国引进最早、使用数量最多的大鼠。该品种也是世界范围内分布最广、使用数量最多的大鼠品种。 Wistar 大鼠生物学特点l 头部较宽、耳朵较长、尾长小于身长(区别于其它品种)。l 性周期稳定、早熟、繁殖力强、产子多,平均10只/胎。l 生长发育快,性情温顺。l 对传染病的抵抗力强,自发性肿瘤发病率低。2、S.D.大鼠l 白化封闭群大鼠。是Sprague-Dawley白化大鼠的简称。l 1925年,美国Sprague和Dawley在农场用Wistar大鼠育成。S.D.大鼠的品种
21、特点:l 头部狭长,尾长近于身长;l 生长发育比Wistar 快;l 抗病力强,尤其对呼吸系统疾病抵抗力强。自发性肿瘤发病率低;l 对营养缺乏敏感,对性激素感受性高。三、豚鼠 Guinea Pig, Cavia Porcellus 豚鼠的生物学特性1一般特征 豚鼠属草食性动物,喜食纤维素较多的禾本科嫩草。在自然光照条件下,日夜采食,在两餐之间有较长的休息期。一般拒绝苦、咸和过甜的饲料,对限量喂饲料或饮水也不适应。 温顺、胆小。豚鼠特别胆小,易受惊吓,突然的惊吓能造成损伤、甚至死亡。对温度、声音、颜色和物体的形态变化都有反应。 听觉发达。豚鼠能识别11种不同的声音,它听到的音域也远大于人类。豚鼠
22、有普赖厄反射(听觉耳动反射),表现为耳廓竖起以应答尖锐的声音。该反射机能的减弱或缺失是听觉机能不良的表现。 体内不能合成维生素C,必须经饲料或饮水补充。(缺乏左旋葡萄糖内酯氧化酶)。对饲料更替敏感。有食粪癖。 对抗菌素及某些有毒物质特别敏感。如,豚鼠对青霉素的敏感性是小鼠的1000倍。豚鼠对青霉素、四环素、红霉素、金霉素、杆菌肽等抗生素均十分敏感。较大剂量用药后,48h后即可出现急性肠炎,甚至死亡。DDV消毒,饲喂发霉饲料等物质,都可造成大批死亡。 盲肠巨大,典型的草食动物特征。2生理学特性 豚鼠妊娠期长,新鼠出生后即能活动。体重一般为50-115g,据产仔数多少而不同,生长发育较快。成年体重
23、:900-1000g,700-900g。常用体重250-300g,过敏实验及支气管痉挛实验常选用150-200g。 全年多发情期动物,发情周期15-17天,妊娠59-72天。每胎产子2-5只。 和其他啮齿类动物一样,豚鼠的牙根也为开放性的,持续生长。不同的是,由于其臼齿和前臼齿的过度生长,其牙齿除了切齿外常常咬合不齐。 性别鉴别:用手指压迫会阴部,雄性的会有阴茎凸出,雌性为一圆孔。血液系统l 红细胞指数低。如,RBC 56109/L, HGB 110150g/L。l 血中补体含量高,补体结合实验。l Kurloff Cells 。在怀孕期间和雌激素刺激时血流中出现一种特殊的单核白细胞(call
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