[其它课程]2-1植物组织与细胞培养技术.ppt
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1、Please be quiet, 上课了!,第二章 植物组织与细胞培养,一、 植物组织培养定义,是指在无菌的条件下,将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制的培养基上,给予适当的培养条件,诱发产生愈伤,长成新的完整植株的一种实验术。,1、探索阶段(20世纪初至20世纪30年代) 1902年,德国植物学家哈伯兰德(Haberlanclt)就预言,植物细胞具有全能性,即高等植物的器官和组织可以不断分割,直至分到单个细胞的观点,并设想离体植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。 而且进行了相关实验:培养植物叶片细胞。 因此,被称为 植物组织培养的father,二 、发展历史
2、,2、奠基阶段(20世纪30年代中至50年代未),两个重要发现:1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义; 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。,1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养,将银杏胚乳提取物加入培养基,获得成功。 1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2,4-D等。B簇维生素。 1934年,美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系,使根的培养首次获得了真正的成功。(培养基:无机盐、酵母提取物和蔗糖,后来用3种B族维生素:吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功) 1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现
3、培养基中加了B族维生素和IAA后,形成层的生长明显增加,揭示了B族维生素和IAA在植物组织培养中的作用,直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。 1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组织培养的奠基人。,1943年,white 正式提出了植物细胞具有全能性的学说. 1948年,Skoog和催澄在烟草茎段和髓培养以及器官形成的研究中发现,腺嘌呤或腺苷可以解除生长素(IAA)对芽形成的抑制作用,而诱导形成芽,从而确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 1956年,Miller发现了激动素后,用它代腺嘌呤的效果更好。 195
4、8年,在美国工作的英国人Stewward,从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中,诱导分化产生了个体植株,给“全能性”理论以科学论证。,3、迅速发展阶段(20世纪60年代至现在) 1960年,Cocking用真菌纤维素酶在番茄幼根分离得到大量活性原生质体,开创了植物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。 1960年,Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功,导致欧洲、美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。(茎尖-原球茎-小植株) 1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成,这就是目前我们常用的MS培养基。 196
5、4-1966年,印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉诱导得到了单倍体植株。 1970年Power首次成功实现原生质体融合。1971年Takebe等首次由烟草原生质体获得再生植株,这一成功促进了体细胞杂交技术发展,同时也为外源基因导入提供了理想的受体材料。1972年,Carlson等通过原生质体事例首次获得了两个烟草物种的体细胞杂交种。 1978年Murashige提出了人工种子的概念。 20世纪80年代初,随着土壤农杆菌成功的用于植物遗传转化,植物基因工程开始成为研究的热点。1983年Zambryski首次用农杆菌转化烟草,获得首例转基因植物。,三、特点,1.
6、培养条件可人为控制 2.生长周期短繁殖率高 3.管理方便,利于自动化 4.遗传品质一致 5.培养材料经济 6.误差小、重复性强,四、意义和应用,(1)能够有效保持优良品种特性 (2)获得无病毒植株 (3)快速繁殖新品种,加速优良品种推广 (4)节约耕地,提高农民产品产出率 (5)在遗传、生理生化和病理等研究上的应用 (6)便于运输与种质资源保存,五 、 实验室、设备要求和实验室设计,植物组织培养是在无菌的条件下进行离体植物材料培养的技术。要达到无菌操作和无菌培养, 首先是要有一定的无菌环境,使用无菌的容器和用具(经过灭菌处理的)进行无菌操作,将无菌的植物材料接种在无菌的培养基上, 然后把要培养
7、的植物材料放在一定的温度、湿度、光照、营养条件下,使其生长、发育和繁殖,这就必须要有一定的设备和条件。,51 植物组织培养室的基本结构 选址: 在建造植物组织培养室时,应选择采光好、通风好、环境干净的地点,以利于组织培养的顺利进行和降低培养过程的污染率。 实验室:植物组织培养工作的开展除需要培养室外,还应该有与之配套的洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、细胞学实验室、暗室和物品存放室等。,(1)洗涤室 洗涤培养容器、小用具等,要求有工作台面、上水和下水,水池、培养容器摆放支架、电源、电热干燥箱等。洗涤室墙壁要有耐湿、防潮功能。 新购进的玻璃器皿首先要用1%左右浓度的稀
8、盐酸将可溶性无机物除去,再用中性洗涤剂洗涤,一般器皿的洗涤可用洗衣粉洗涤,或用洗衣粉加热洗涤,用自来水冲洗干净。,对较难洗涤的培养容器,如吸管等可在重铬酸钾洗液中浸泡后再洗,洗到玻璃表面上不沾水滴才算合乎要求。,(2)药品贮藏室 要求干燥、通风,避免光照,有存放各种药品试剂的药品柜、冰箱等设备,化学试剂、玻璃器皿等物品分类存放于柜中,有毒物品(HgCl2)需要专人密封保存,需低温保存的药品和药液放置于冰箱中贮藏,药品贮藏室紧邻化学称量室较好,便于工作。,(3)称量室(天平室) 要求干燥、密闭,无直射光照,避免腐蚀性药品和水气直接接触。有固定的水磨石平台,安放普通天平和万分之一分析天平(电子天平
9、),要有电源插座,最好设计在阴面的房间,这样对怕光药品的保存和称量有利,称量室紧邻培养基配制室较好,以方便配制母液和培养基。如房间较少时,可以与药品储藏室合二为一。,(4)培养基配制室 主要进行培养基的配制、分装和灭菌前的暂时存放。配制的培养基需要实验台,上下水,电源,加热设备等。 配制培养基室要求备有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管等玻璃器皿,有安放药品和器皿的各种橱架、水浴锅、过滤灭菌装置和酸度计等。 规模较小时, 可与洗涤室合并在一起。,(5)培养基灭菌室 器皿和培养基的消毒灭菌,最好在一个专用的灭菌室内进行。由于采用高温高压蒸汽灭菌方法,灭菌室最好有排除蒸汽的排风扇等。建筑上要求其墙
10、壁耐湿、耐高温。 有用于干热灭菌的烘箱、湿热灭菌的高压蒸汽灭菌锅、蒸馏水器、水源、水池,供、排水设施。 有用于灭菌的两相和三相电源或煤气加热装置,摆放和存放器皿和培养基的架子和橱柜。 规模小时,可与洗涤室和配培养基室合并。,(6)培养基存放室 灭菌的培养基最好存放一段时间后进行接种工作,以防污染和损失苗木。 规模小时,可与洗涤室、配培养基室和灭菌室合并。,(7)过度室(缓冲室) 为避免进出时带进杂菌,无菌室外应该设置预备室,作为缓冲间。预备室和无菌室之间最好用玻璃墙隔离,便于观察和参观。 在预备室中可放置工作服、鞋、帽等,也需要安装自来水、水池和紫外灯,用于接种前的洗手和紫外灭菌,电源开关最好
11、安装在预备室外边,以免在开关灯时紫外线对眼睛和皮肤造成伤害。,(8)接种室 无菌室的好坏对组织培养成功与否起重要作用。无菌操作室主要进行繁殖材料的表面灭菌和试管苗的继代培养和材料转接,要求室内干净、密闭,光线好。 一般安装滑动门,以免造成空气流动,引起污染。 室内墙壁光滑平整,地面平坦无缝,便于清洁工作。 应该安装紫外灯,以便照射 灭菌,还要有照明装置及插 座,以备临时增加设备之用。,室内有超净工作台、接种用的小推车以及试管、三角瓶、塘瓷盘、酒精灯、接种工具等。 平房易吸潮,容易引起污染,因此有条件的设计应选择楼房,最好在二层或二层以上,与其他区域隔离。 为保证无菌室的良好条件,可预先用福尔马
12、林熏蒸,工作台用70%酒精药棉擦拭,在 开紫外灯灭菌前应 该把所有需要的物 品放入。不要造成 死角,以免紫外灯 无法照射到。此外 还应该设有消防设施。,2019/1/30,22,(9)培养室 培养室是培养材料进行培养和生长的场所,培养室的大小应根据培养架的数量和生产规模而定。 植物组织培养需要较长的培养时间,同时还须考虑温度和光照的影响。通常培养室的温度保持在适宜一般植物生长的范围内,多为2027 ,光照强度在1000 lx以上。 一般光照强度1000-5000 Lx, 每天光照时间816 h。,培养室应设计成多个小培养间比一个大房间效果好,因为小的培养间容易控制温度、光照等环境指标,特别是培
13、养材料较少时节能效果更为明显。 培养多种植物时的优点更为突出,如不同植物所需的培养温度、光周期不同,所设定的培养温度和光周期不可能适合培养的每一种植物。小培养间也可以减少污染,培养室容易消毒和保持清洁。 至少设计成一大一小两间培养室,这样可以防止万一环境污染,不至于全军覆没;也可以用大的培养间大量繁殖苗木,小的用来科研及少量珍稀品种试验;当不同培养材料需要不同的培养条件时,便于分别处理。,(10)细胞学实验室 为观察、记录培养材料的生长情况及实验结果,需要有细胞学实验室。细胞学实验室应有固定的水磨石台面,放置显微镜、解剖镜等仪器。室内应安静、干净、清洁、明亮,保证光学仪器不振动、不受潮、不污染
14、。室内还应该有一套染色设备,因为有时为了观察清楚需要染色或进行制片观察。,(11)暗室 试验材料的摄影记录,一般可以用装有照相装置的显微镜、解剖镜进行,有时需要用照相机直接拍摄完整材料。 进行拍摄后需要冲卷和洗相,这就必须有配套的暗室,以便及时看到结果。 在暗室应有冲洗、印相、放大、上光等设备。 有固定的水泥工作台面,还要有电源和自来水装置。,(12)物品存放室 暂时不用的器皿、用具等贮存在物品存放室内。物品存放室应当设计在背阳、通风的房间,室温较低,一般用楼房的低层的阴面房间较好,便于搬运。,(13)温室(大棚) 试管苗移栽必须在温室或塑料大棚内进行。试管苗移栽时一般要求温室最低温度在15
15、以上,相对空气湿度在70%以上。,52组织培养常用仪器设备及要求 (1)玻璃器皿 植物组织培养工作对玻璃器皿的需要是灵活多样的,多种器皿都可使用。玻璃器皿最好用硼硅酸盐(即派热克斯玻璃)材料制造,一般要求溶解度小,其形状可根据研究工作的目的和要求而定。 (A) 培养容器 培养用的玻璃器皿要求透光度好,能耐高压蒸汽灭菌。根据培养目的和要求不同,可采用不同种类和规格的玻璃器皿。,试管 在需要少量培养基进行研究、接种外植体或进行幼胚培养(如桃幼胚等)的实验中,可以选用试管进行培养。要求试管口径要大、长度稍短,便于操作,以2.0cm15cm、2.5cm15cm、3.0cm15cm为宜。 三角瓶 又叫三
16、角烧瓶和锥形瓶,具有瓶口小,瓶底大,培养面积大,受光好,易放置,培养效果好,在植物组织培养中最常用。接种外植体时多用容积为50mL的三角瓶,一般实验用100mL的三角瓶,生产育苗多用150mL的三角瓶。近年来,三角瓶在组织培养中的应用愈来愈广泛,无论是固体培养还是液体培养,都可用三角瓶。一般用口径2.5cm3cm的大口径三角瓶较好。,果酱瓶或罐头瓶 成本低,瓶口大,操作方便,透光好,培养材料生长健壮,但培养污染率较高。生产中应用较多的是200mL的果酱瓶,也有用较大的罐头瓶。 培养皿 在无菌材料分离、滤纸灭菌、种子发芽、病毒鉴定时较常用,其规格有直径6cm、9cm、12cm的。固体平板培养一般
17、采用直径6cm的小型培养皿。此外,可以用培养皿室内催芽,以供培养时取材之用。在无菌室还可以在培养皿中解剖茎尖、分离花粉、切割继代培养物及其他外植体或培养材料。,植物组织培养专用容器 这是一种新型组培专用容器,采用进口高分子PC(俗称太空玻璃)为主要材料生产,在高压蒸汽灭菌条件下反复使用不破裂、不变形,使用寿命长,透光率高于玻璃容器。最大的优点是不易破碎,符合机械化洗瓶要求,利于降低损耗和工厂化生产。 瓶口包扎,以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。可用多种方法,通常以纱布包被棉花塞,外边再包一层牛皮纸,用线绳或橡皮筋捆扎,也可用封口膜、铝箔、双层硫酸纸、耐高温的塑料纸、耐高温的塑料盖。,(B)
18、 盛装器皿 盛装容器主要是存放各种试剂和药液。 磨口瓶 包括无色和棕色两类,细分为广口瓶、细口瓶,规格有1000mL、500mL、250mL、125mL,广口瓶用于存放试剂,细口瓶用来分装配制好的各种母液。不易保存的母液存于冰箱中低温保存,见光易分解的药品可用棕色瓶安全保存。 滴瓶 盛装一定浓度的酸液或碱液,用于调节培养基的pH值。其中碱液用塑料滴瓶更好。,搪瓷锅(盆)或不锈钢锅(盆) 用于配制和熬制培养基,研究可用较小的规格,如1000mL规格的搪瓷缸,或4000mL规格的搪瓷锅,生产上要选较大的规格,如8000mL或更大规格的不锈钢锅较好,可提高劳动效率。 烧杯 规格有1000mL、500
19、mL、250mL、125mL、50mL,用于配制各种母液和培养基。 (C) 计量器皿 计量器皿要求有准确的刻度,以便于在配制各种母液及培养基时能准确定量,减少实验误差。 容量瓶 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL,用于配制各种母液时定容。,刻度吸管 又叫移液管,规格有10mL、5mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL。用于吸取各种母液。 量筒 规格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、25mL 、10mL、5mL,用于配制不同浓度的酒精和配制培养基时吸取大量元素母液等。 (D)其他 除以上各种容器外,还应具备一些其他玻璃器皿,如漏
20、斗、称量瓶、玻璃棒等,以便用于培养基的制备等工作。有条件时,还可以配备培养基分装器,由大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹等构成。此外,还有量筒式分装器,上有刻度,下有橡皮管及铁夹控制。微量分装可用注射器。,(2)仪器与设备 天平 可以根据实际需要配备选择如下称量仪器。天平应放在干燥,避免震动,无腐蚀性药品的地方,应尽量避免移动,天平匣内应放硅胶或其他中性干燥剂以保持干燥。 (A) 药物天平称量精度为0.1g,用来称取蔗糖和琼脂等。 (B) 扭力天平 既移动方便,又较为灵敏的称量仪器,可弥补药物天平和分析天平各自的不足,精度为0.001g,而且在1g 内的物品不用加砝码,故使用方便。 (C) 分析天平
21、 精度为0.0001g,用来称取微量元素和植物生长调节物质及微量附加物。选择平稳,干燥,没有腐蚀性药品和水气的地方放置天平。,(D) 电子天平 精度高、称量快、但价格较高。 冰箱 分普通冰箱和低温冰箱。某些试剂、药品和母液需低温保存;有些材料需低温处理。一般备有家庭用冰箱即可。 烘箱和恒温箱 洗净后的玻璃器皿,如需迅速干燥,可放在烘箱内烘干,温度以80100为宜。若需要干热灭菌,温度升高至150180,持续13h即可。在进行培养物的干重分析时,可在80条件下烘干。 恒温箱即可用于植物原生质体和酶制剂的保温,也可用于组织培养中暗培养。恒温箱内装上日光灯可进行温度及光照方面的小型实验。,显微镜 一
22、般用双目体视显微镜较多,用于剥取茎尖以及隔瓶观察内部植物组织生长情况。同时也还要有生物显微镜,用以观察花粉发育时期及培养过程中细胞核的变化等。此外,倒置显微镜可以从培养器皿的底部观察培养物,因此,在液体培养时,可用倒置显微镜进行观察。 酸度计(pH试纸也可) 培养基中的pH值十分重要,因此,在配制培养基时,需要用酸度计测定和调整。一般用小型酸度测定仪,既可在配制培养基时使用,也可测定培养过程中pH值的变化。若不做研究,仅用于生产,也可用精密pH47的试纸来代替。测定培养基pH值时,应注意搅拌均匀后再测。,蒸馏水器 水中常含有无机和有机杂质,如不除去,势必影响培养效果。植物组织培养中常使用蒸馏水
23、或去离子水,蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备,要求更高的用硬质玻璃蒸馏水器制备。去离子水是用离子交换器制备的,成本低,但不能除去水中有机成分。一般生产性的组培育苗,对水要求不太高,除配制各种母液用蒸馏水或去离子水外,配制培养基所用水可以用自来水代替,如果当地水质较硬,可以用煮沸过并沉淀去杂质后的白开水,以降低生产成本。 空调器(空气调节器) 夏季高温不利于试管苗生长繁殖,常常造成组培苗生长不良,或引起玻璃化等不良反应,需要购置空调器降温,空调器功率应根据培养室大小来定。,超净工作台 如有条件购置先进设备超净工作台,既方便,又舒适,无菌效果又好,它可代替无菌室和接种箱。超净工作台原系工业用于半导体
24、元件与精密仪器仪表的装置,现已成为植物组织培养上最常用、最普及的无菌操作装置。它有单人、双人、及三人式的,也有开放和密封式的。超净工作台一般较宽,购置和设计房屋时应注意,以防房门太窄而搬不进去。超净工作台主要是通过风机,将送入的空气经过细菌过滤装置,再流过工作台面。因此超净工作台应放置在空气干净、地面无灰尘的地方,以延长使用期。使用过久,引起堵塞,需要清洗和更换过滤器。,培养架 进行固体培养和试管苗大量繁殖时,需要有放置培养瓶的培养架。制作培养架时应考虑使用方便、节能、充分利用空间以及安全可靠。架子可用金属、木材制作,隔板可用玻璃、木板、纤维板、金属板等,最好用平板玻璃或铁丝网,既透光,上层培
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